caracteristique moléculaire et épigenetique des leucémies aiguës myéloides de l’enfant

contexte scientifique les leucémies aiguës sont le cancer le plus fréquent chez l’enfant, 15% sont identifiées comme des lam sur les critères de différentiation myeloïdes des blastes. les lam sont des pathologies hétérogènes mais ont en communs le modèle de leucémogenèse en deux étapes: le premier hit leucémique touchant un gène impliquée dans la prolifération cellulaire et le second un gène impliqué dans la différentiation. les mutations ou les altérations épigénétiques atteignant les gènes mll, hox ou le complexe cbf appartiennent à ce dernier type d’événements et entraine un blocage de différentiation et sont impliquées aussi bien dans la leucemogenèse myéloïde que lymphoïde. bien que beaucoup d’événement leucémique soient communs aux adultes et aux enfants, il existe des différences significatives. les partenaires de mll dans les réarrangements des lam-mll+ sont différents en fonction de l’âge et de plus les lam–mll+ sont souvent associées avec des recombinaison illégitimes des gènes d’immunoglobulines ou du tcr chez l’adulte mais rarement chez l’enfant. les réarrangements du gène mll et les caryotypes complexes sont plus fréquent chez les enfants de moins de deux ans alors que les mutations sont moins communes et peu étudiées. ces différences reflètent très certainement des mécanismes physiopathologiques distincts et probablement liés aux différences dans l’hématopoièse selon l’âge. c’est pourquoi il peut être intéressant de comparer les lam et les la peu différenciées pédiatriques avec celles de l’adulte. descriptif du projet l’essai clinique elam02 a inclus 435 enfants et peut donc maintenant être une base pour l’exploitation en recherche clinique translationnelle. nous proposons d’étudier ex vivo les blastes pour identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires spécifiques des lam de l’enfant au moyen d’une comparaison avec une cohorte de patients adultes enrôlés dans les essais cliniques de l’alfa dont les échantillons ont été caractérisés en transcriptomique et en profilage génomique de snps. nous proposons les investigations suivantes sur cette cohorte. (i) identification de nouvelles mutations impliquées dans les lam de l’enfant les mutations seront recherchées par approche haut débit d’une part en séquençage whole exomes pour 24 lam de l’enfant sans anomalie cytogénétique ou moléculaire connue et d’autre part par résequençage ciblé sur 200 gènes connus comme impliquées dans des processus oncogènes ou dans l’hématopoièse sur 250 cas de lam pédiatrique. (ii) comprendre les spécificités des anomalies moléculaire de la leucemogenèse du jeune enfant une approche transcriptomique permettra de comparer des cas de lam d'enfants de moins de 2 ans avec des enfants plus agés atteint de lam ou de la peu differenciées et le tout comparé avec des cas homologues chez l’adulte. la recherche de modification épigénétique sera faite par pyroséquençage ciblé sur des cas mll germline matchés avec des cas mll+ (iii) caracterisation du role clef de l’inactivation de runx1 etde la voie notch1 dans les la pédiatrique l’interface d’engagement t ly, my de même que l’identification préalable des la peu différenciées de l’adulte vont être comparé à leur contrepartie chez les enfants. l’engagement lymphoïde t sera apprécié par la recherche de mutations telle que calm-af10 et par le screening des paramètres immunologiques ainsi que par l’étude du statut des réarrangements du tcr. a la suite de l’identification dans les lam (cbfb-myh11) de l’adulte de l’existence d’un programme d’engagement à minima lymphoïde t nous nous proposons d’essayer de voir si la fusion cbfb-myh11 apparaît dans un progéniteur totipotent de la moelle ou plutôt dans une cellule engagée dans la voie de différentiation t ou dans un progeniteur intra thymique. l’effet de l’extinction des fonctions du complexe cbfsera également étudié. ainsi les caractéristiques de 60 lam pédiatrique du groupe cbf seront comparées à celle de l’adulte et à des lal early t. résultats attendus la comparaison des lam et de la indifferenciées entre l’adulte et l’enfant devrait améliorer nos capacités diagnostique et la stratification thérapeutique. l’approche transcriptomique autorisera l’identification de nouvelles voies oncogéniques probablement liés à l’âge. les protéines impliquées dans ces voies devraient permettre une approche de diagnostique en cytometrie multiparamétrique montrant l’hétérogénéité des populations leucémiques qui devrait aider à la stratification thérapeutique entre protocole type lam ou lal chez ces patients à la mal differenciées. l’identification des modifications épigénétiques à l’interieur des lam-mll+ devrait permettre de nouvelles approches thérapeutique.

scientific context acute leukemia (al) is the most frequent pediatric neoplasia, of which 15% are acute myeloid leukemia (aml). pediatric aml is clearly heterogeneous, including alterations that regulate self-renewal and proliferation and those that determine differentiation. mutations or epigenetic alterations involving the cbf (runx1 and, or cbf ) or mll, hox gene complexes belong to the latter and are involved in both myeloid and lymphoid oncogenesis. significant differences exist between pediatric and adult aml: mll+ aml rearrangement partners differ with age and mll+ amls are associated with “illegitimate” antigen receptor (ig, tcr) rearrangements in adults but not children- dnmt3a and idh2 mutations are relatively uncommon in pediatric aml. differences even exist within pediatric aml: mll-rearrangements and complex karyotypes are more frequent in children under two years, whereas mutations are less common and rarely studied. these differences are likely to reflect distinct pathogenic mechanisms and age related differences in hematopoiesis, well recognised for lymphoid and erythroid differentiation but probably as important in myelopoiesis. it is therefore important to compare pediatric aml with adult aml and immature, non-lineage restricted al. description of the project the elam02 pediatric aml trial has accrued 435 patients and is now ready for translational exploitation. we propose to study ex-vivo blasts to identify molecular and cellular mechanisms specific to childhood aml by means of comparison with a fully characterised (including gene expression profiling, gep and dna profiling) matching cohort of adult patients enrolled on the alfa clinical trial. investigations will include: (i)-identification of novel gene mutations involved in pediatric aml. mutations will be accessed by (i) whole exome sequencing in the genome of 24 patients with no cytogenetic abnormalities or classical aml somatic mutations and (ii) by systematic ngs targeted resequencing in 250 aml patients of 200 genes known to be oncogenes, tumour suppressor genes or to be involved in hematopoiesis. (ii)-understanding the specificity of acute myeloid leukemogenesis in young children. gep will be compared in 50 aml from children under 2 years with older childhood with immature and myeloid restricted aml and with matched adult aml. assessment of epigenetic status will be performed by pyrosequencing from both mll translocated and mll germline cases. (iii)- caracterization of the role of cbf inactivation in immature aml and etp all previously identified adult immature al at the interface between t-all and aml will now be compared with their pediatric counterparts. early t lymphoid orientation in aml will be searched for by screening for oncogenic abnormalites such as calm-af10 and immunogentic parameter, particularly tcr rearrangement. following identification of an asynchronous t lymphoid program in cbfb-myh11 aml, we will characterize the basis of this program, by studying epigenetic regulation of cd2 expression and by determining whether the initial cbfb-myh11 occurs in a bone marrow totipotent progenitor, a t lymphoid orientated progenitor or in an early thymic precursor. the effect of cbf abrogation will be studied characteristics of 60 cbf aml in children will also be compared with their adult counterparts in aml and early t-all. expected results and scientific and medical potential impact of the translational research comparison of pediatric aml with adult aml and undifferentiated al will improve diagnostic and therapeutic stratification of both disorders. gep analysis will allow identification of novel oncogenic pathways, of age related differences in matched genetic subgroups and identification of relevant proteins for development of flow cytometric panels which can be used to stratify treatment from day1. identification of “cbf-like” undifferentiated al, some of which appear to do relatively well on all protocols will contribute to improved orientation between aml and all protocols. unravelling the epigenetic mechanisms leading to mll+ aml will also allow evaluation of targeted inhibitors of potential epigenetic regulators in this particularly poor prognostic subgroup of pediatric aml. the convergence of translational research in pediatric and adult aml will also provide bilateral synergy, as recently observed for clinical management in adult and pediatric all.