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contexte scientifique l'initiation et la progression des hémopathies myéloïdes (hm) résultent d'une succession d'anomalies génétiques acquises clonales de la cellule souche hématopoïétique (csh), primaires ou secondaires, qui ne sont que partiellement connues. en collaboration avec l'inserm e210 (o. bernard) et l'inserm u567 (m.fontenay), notre groupe a récemment identifié un nouveau gène suppresseur de tumeur (ten-eleven translocation-2, tet2) altéré par déletions, mutations dans 15% des syndromes myéloprolifératifs (smp), et dans plus de 20% des syndromes myélodysplasiques (smd) et des leucémies aiguës secondaires (lamii). tet2 appartient à une famille de 3 gènes de fonctions inconnues. nos résultats suggèrent que l'inactivation de tet2 est un événement oncogénique conduisant à une expansion du clone malin lors des phases précoces de la myélopoïèse, indiquant que cette protéine de plus de 2000 acides aminés pourrait avoir une fonction clé dans l'hématopoïèse et la biologie des csh. notre objectif est de développer les techniques permettant de déterminer la nature des anomalies de tet2 et d'étudier leur implication dans l'initiation, la progression et le pronostic des hm. descriptif du projet: l'étude a pour objectifs de : 1)développer les outils moléculaires pour la détection des anomalies de tet2dans un premier temps, nous développerons plusieurs techniques permettant la détection des anomalies de tet2, qmpsf et séquençage pour la détection de déletions, insertions et mutations, rq-pcr pour l?étude de l'expression de l'arnm, et des techniques étudiant la méthylation du promoteur de tet2. 2)identifier les sous-populations de patients atteints d'hm avec anomalie de tet2dans un deuxième temps, nous caractériserons les patients porteurs d'anomalies de tet2. nos résultats préliminaires suggèrent que nous trouverons des anomalies de tet2 dans les lamii, dans différents types de smd, et dans les smp porteurs ou non de mutations de jak2 ou mpl. plus de 400 smd et lam et plus de 800 smp devront être étudiés. nous conduirons une étude rétro-prospective pour définir au diagnostic les principales caractéristiques biologiques des patients tet2 au sein de chaque catégorie d'hm. au delà des données de l'hémogramme, nous analyserons des paramètres biologiques adaptés à chaque type d'hm: cytologie médullaire (dysplasies), cytogénétique (anomalies caryotypiques associées), biologie moléculaire (mutations de nras), culture de progéniteurs (cfc), analyse transcriptomique dans les smd et les lamii - cytologie et histologie médullaire, biologie moléculaire (mutations de jak2 ou mpl, quantification), cytogénétique, culture de progéniteurs et analyse transcriptomique dans les smp. 3)comparer les propriétés biologiques des csh de patients atteints d'hm porteurs ou non d'anomalies de tet2nous émettons l'hypothèse que tet2 a une fonction importante dans la biologie des csh. parallèlement à l'étude fonctionnelle systématique, nous effectuerons une étude comparative des propriétés des csh et progéniteurs hématopoïétiques de patients porteurs ou non d'anomalies de tet2. nous utiliserons des techniques in vitro de cultures de progéniteurs et des techniques in vivo de repopulation de souris immuno-déficientes (nod, scid, nog) par greffe xénogéniques de cellules cd34+ de patients. résultats attendus ce travail devrait permettre le développement d'outils moléculaires pour le diagnostic et éventuellement le suivi des anomalies de tet2. nous pensons que la définition de sous-populations de patients en fonction de la présence ou de l'absence d'anomalies de tet2 sera un élément important pour la classification des hm. ce travail devrait aider à l'évaluation de la valeur pronostique des anomalies de tet2, et à la stratification des patients pour les futures études cliniques ou thérapeutiques. ce travail permettra également de mieux comprendre l'oncogénèse myéloide et la fonction de tet2.

scientific context the initiation and progression of the myeloid malignancies result from the acquisition by the hematopoietic stem cell (hsc) of a succession of primary or secondary clonal genetic defects, which remain largely unknown. in collaboration with inserm e210 (o. bernard) and inserm u567 (m. fontenay), our team has recently identified tet2 (ten eleven translocation 2) as a new tumor suppressor gene affected by acquired mutations or deletions in 15% of myeloproliferative neoplasms (mpn) and in more than 20% of myelodysplastic syndromes (mds) and secondary acute myeloid leukaemias (saml). tet2 belongs to a three gene family of unknown functions. our results suggest that the inactivation of tet2 leads to the expansion of the malignant clone during the early steps of myelopoiesis. we hypothesize that this large 2002 residue protein could have an important function in hematopoiesis and hsc biology. our aim is to develop techniques to determine the nature of tet2 defects and to study their involvement in the initiation, the progression, and the prognosis of various myeloid malignancies. description of the project: this study has three aims 1)develop molecular tools for the detection of tet2 defectswe will first develop several molecular tools, such as sequencing and qmpsf techniques for the detection of deletions, insertions, and mutations, rq-pcr techniques for mrna quantification, and techniques to study the methylation of tet2 promoter. this development will then be useful to study the impact of the detection of tet2 defects on the diagnosis and prognosis of myeloid malignancies. 2)identify patient subsets with myeloid malignancies and tet2 defectswe will then characterize the patients with tet2 defects. we expect to find tet2 defects in 15 to 30% of saml, mds, and mpn with or without jak2 and mpl mutations. we will test more than 400 mds, aml patients and 800 mpn patients originating from two multicentric networks. we will determine the main biological characteristics of patients with or without tet2 defects within each category of myeloid malignancies (mds, saml, mpn). we will study common biological features and parameters specific to each disease: cytomorphology, cytogenetics, nras mutation detection, colony forming cell (cfc) cultures, and transcriptomic analysis in mds, aml- and bone marrow cytomorphology, histology, jak2, mpl mutations, colony forming cell (cfc) cultures, and transcriptomic analysis in mpn. 3)compare the biological properties of hsc from patients with or without tet2 defectswe hypothesize that tet2 has an important function in hsc biology. in parallel with a systematic study of tet2 function we will compare the biological properties of hsc and progenitors from patients with tet2 defects to those from patients without tet2 defects. we will use cd34+ cells from myeloid malignancies patients and perform in vitro progenitor culture techniques and in vivo immuno-deficient (nod, scid, nog) repopulation assays. expected results this work will allow the development of molecular tools for the diagnosis, and eventually the follow up of tet2 defects. we anticipate that the definition of subsets of patients according to the presence of tet2 defects will have an impact in myeloid malignancies classification. this work will help determining the prognostic value of tet2 defects and stratifying the patients for future clinical and therapeutic trials.tet2 is a new tumor suppressor gene that probably plays an important role in hematopoiesis and in hsc biology. however its precise function is still unknown. the comparative study of the biological properties of the hsc and progenitors from patients with or without tet2 defects will contribute to a better understanding of its function and of the myeloid oncogenesis in general.