place des altérations constitutionnelles ou somatiques du gène alk dans le développement du neuroblastome

contexte scientifique le neuroblastome (nb) est la tumeur solide extra-cérébrale la plus fréquente de l'enfant. il s'agit d'un cancer du système nerveux sympathique périphérique présentant une grande hétérogénéité clinique. l'identification des gènes impliqués dans l'oncogenèse de cette tumeur représente un enjeu majeur dans la compréhension de cette pathologie pédiatrique. le nb survient majoritairement dans un contexte sporadique, néanmoins de rares formes familiales sont observées. récemment, notre équipe, ainsi que 3 autres laboratoires, a identifié le gène alk (anaplastic lymphoma kinase) en tant qu'acteur majeur du nb, à travers la caractérisation de mutations activatrices, somatiques et germinales, de ce récepteur. description du projet notre programme scientifique se propose d'aborder les problématiques suivantes : 1. corrélations génotype, phénotype afin de déterminer si les différentes mutations du gène alk sont associées à des caractéristiques cliniques particulières, des mutations seront recherchées dans une très large série de tumeurs pour lesquelles nous disposons d'annotations cliniques complètes. 2. caractérisation d'autres types d'altérations affectant le gène alk certaines observations suggèrent que le gène alk puisse être activé dans certains nb suite à des translocations chromosomiques, aboutissant potentiellement à des transcrits de fusion. des réarrangements du gène alk seront recherchés et caractérisés par cgh-array à très haute résolution, fish, 5' race et pcr inverse ainsi que par des stratégies de séquençage massif. 3. analyse d'inhibiteurs spécifiques de alk à l'aide de modèles précliniques in vivo l'activité antitumorale d'un inhibiteur spécifique de alk, le ldk378, sera explorée contre un panel de 6 xénogreffes de nb sélectionnés en fonction du statut du gène alk et de l'activation d'effecteurs d'aval. l'inhibition in vivo de l'activation de alk sera évaluée par western blot et immunoprécipitation. cette démarche permettra de déterminer si l'inhibition de alk pourrait être utilisée chez des patients atteints de nb. 4. analyse des altérations constitutionnelles dans le nb 4.1 analyse de familles de nb ne présentant pas de mutations germinales des gènes alk et phox2b la prédisposition au nb demeure inexpliquée dans de nombreuses familles. nous souhaitons combiner une approche de gènes candidats et des analyses pan-génomiques à haute résolution afin de rechercher l'origine génétique de la prédisposition tumorale. 4.2 malformations congénitales et prédisposition tumorale afin d'explorer l'hypothèse d'une origine génétique commune au nb et aux anomalies développementales, nous souhaitons établir un inventaire clinique de l'ensemble des nb survenant dans un contexte syndromique, dans le cadre d'un programme collaboratif. les échantillons tumoraux et adns constitutionnels seront collectés et analysés. après avoir exclu l'implication des gènes alk et phox2b, des altérations seront recherchées par des analyses pan-génomiques à haute résolution et séquençage direct de gènes candidats. résultats attendus les approches proposées permettront de mieux documenter l'implication du gène alk dans l'oncogenèse du nb et de déterminer si le gène alk peut être activé par des mécanismes différents des mutations ponctuelles et des amplifications. les résultats attendus devraient permettre de sélectionner les patients qui pourraient bénéficier d'une thérapie ciblée. ce travail devrait nous amener à proposer des recommandations pour le suivi et le traitement des patients atteints de nb ainsi que pour la surveillance des individus porteurs de mutations des gènes alk et phox2b. ce programme participera par ailleurs à l'identification de molécules inhibant spécifiquement alk. enfin, ce projet pourrait aboutir à l'identification d'autres gènes impliqués dans la prédisposition au nb, particulièrement dans un contexte associant nb et désordres développementaux.

scientific context: neuroblastoma (nb), the most frequent extracranial paediatric solid tumour, is a disease of the sympaticoadrenal lineage of the neural crest characterized by a great clinical heterogeneity. the identification of the genes implicated in nb oncogenesis is a major challenge in the understanding of this paediatric disease. nb usually occurs sporadically but some patients inherit a genetic predisposition to nb. the first gene to be linked to nb predisposition was phox2b, for which mutations occur in a subset of familial or syndromic nb. recently, we and others have identified the alk (anaplastic lymphoma kinase) receptor as a critical player in nb development through the identification of germline and somatic activating mutations in the alk-kinase domain. description of the project: our scientific program will address the following issues: 1. correlations between genotype and phenotype we want to determine whether the various alk mutations observed in nb are associated with particular clinical features. for this purpose, we plan to screen the alk gene for mutations in a very large panel of nb tumours for which full clinical annotations are available. 2. characterization of other types of alterations affecting the alk gene some data suggest that the alk gene may be activated in a subset of nb via chromosome translocations potentially leading to fusion transcripts. alk rearrangements will therefore be investigated in nb samples by high-resolution array-cgh and fish studies. the identification of the fusion partner will be further characterized using 5' race and inverse pcr experiments. we also plan to take benefit of massive parallel sequencing strategies in order to determine breakpoints at the alk locus. 3. analysis of alk-selective small-molecules inhibitors using preclinical in vivo models we will explore the antitumor activity of a selective small molecule alk inhibitor, namely ldk378, against a panel of 6 nb xenografts that will be selected on alk mutation status and activation of downstream effectors. in vivo inhibition of alk activation at optimal doses used in athymic mice will be evaluated by western blot and immunoprecipitation. this will allow to define whether alk inhibition may be relevant for patients with nb and what are the biological determinants that characterize in vivo sensitivity to alk inhibition. 4. analysis of constitutional alterations in nb 4.1 analysis of nb pedigrees without germline mutations in alk and phox2b genes tumour predisposition remains unresolved in many familial cases. we plan to combine a candidate gene approach and high-resolution pan-genomic analysis in order to unravel the genetic cause of tumour predisposition. 4.2 congenital malformation and tumor predisposition we plan to establish a multicentric clinical inventory of all paediatric syndromic tumours including nb, in a collaborative program. biological samples including tumour samples and constitutional dna will be systematically collected. once alk and phox2b gene mutation is ruled out, the search for alterations will rely on whole-genome analysis strategies and direct sequencing of candidate genes. expected results: altogether, these approaches should enable a more precise determination of the implication of the alk gene in nb oncogenesis and reveal potential mechanisms of activation distinct from single-base substitutions and amplification. the expected results should allow to select the patients that could benefit from a specific targeted therapy. we hope to be able to propose guidelines for follow-up, treatment and genetic counselling of carriers of phox2b and alk gene mutations. this program will also participate in the identification of potent and effective alk inhibitors. finally, this work will potentially lead to the identification of other nb predisposing genes based on detailed clinical and molecular study of patients presenting nb and congenital malformation(s).