microsatellites : polymorphismes et hubs d’activation transcriptionnelle dans le sarcome d’ewing (µphase)

la fusion ewsr1-fli1 (ou ses variantes ewsr1-ets) est une altération majeure des sarcomes d’ewing. ewsr1-fli1 est un facteur de transcription aberrant qui contient en c-terminal le domaine de liaison à l’adn de fli1 et en n-terminal le domaine de faible complexité (lcd) de ewsr1. ewsr1-fli1 se fixe soit sur des motifs canoniques ets, soit sur des motifs répétés de la séquence ggaa, ces derniers motifs étant spécifiques car les protéines ets sauvages, et en particulier fli1, ne s’y fixent pas. le domaine lcd de ewsr1 est susceptible d’induire une transition de phase concentration dépendante de type liquide-liquide, entre un état homogène, mélangé, et un état « démixé » dans lequel ewsr1 forme des gouttelettes à l’instar de l’huile dans l’eau. les séquences microsatellite (ggaa) constitueraient ainsi des sites de liaisons multivalents pour ewsr1-fli1, accroissant ainsi sa concentration locale et conduisant à la nucléation de condensats, en particulier de protéines ou complexes protéiques présentant des lcd similaires et nécessaires à la transcription. ce projet propose d’effectuer une analyse détaillée du mécanisme d’action de ewsr1-fli1 : 1- en identifiant des gènes directement et spécifiquement régulés par ewsr1-fli1 au niveau de séquences microsatellites et en appréciant le rôle de leur variation de taille dans l’hétérogénéité inter-individuelle ou intra-tumorale, 2- en évaluant le potentiel d’inhibition de l’activité de ewsr1-fli1 par déplacement de ewsr1-fli1 des séquences microsatellites endogènes et 3- en utilisant les gènes identifiés en 1) pour préciser la dynamique de liaison de ewsr1-fli1 sur les microsatellites endogènes et l’activation transcriptionnelle résultante par des approches d’imagerie optique super-résolutives, et en développant des outils d’optogénétique pour contrôler la séparation de phase. ce projet devrait permettre de mieux comprendre le mécanisme d’action de ewsr1-fli1 et d’ouvrir de nouvelles pistes d’intervention thérapeutique.

the ewsr1-fli1 fusion (or its ewsr1-ets variants) is a hallmark of ewing's sarcomas. ewsr1-fli1 is an aberrant transcription factor that contains the dna binding domain of fli1 (or other ets family transcription factor) in its c-terminus and the low complexity domain (lcd) or prion-like domain of ewsr1 in its n-terminus. ewsr1-fli1 has the ability to bind either to canonical ets motifs, or to microsatellite ggaa repeats, these last motifs being highly specific as wild-type ets proteins, and in particular fli1, cannot bind microsatellites. the lcd domain of ewsr1 is able of inducing a concentration dependent phase separation of the liquid-liquid type, between a mixed, homogeneous phase, and a "demixed", droplet-like state. the currently proposed mechanism of action is that microsatellite sequences act as multivalent binding sites for ewsr1-fli1, thus increasing its local concentration and allowing local nucleation of condensates in particular of proteins or protein complexes with similar lcds. proteins necessary for transcription activation would thus be enriched at the level of microsatellite sequences. in the present project, we aim at a detailed analysis of the mechanism of action of ewsr1-fli1 through: 1- the identification of genes directly and specifically regulated by binding of ewsr1-fli1 to microsatellite sequences and investigation of the role of polymorphisms or instability of these regions in inter-individual or intra-tumor heterogeneity, 2- the evaluation of the potential of ewsr1-fli1 displacement from bound endogenous microsatellite sequences to inhibit ewsr1-fli1 function, 3- the study of the dynamics of the ewsr1-fli1 binding and subsequent transcription activation using super-resolution optical imaging approaches, and by developing optogenetic tools to control the phase separation. this project should lead to a better understanding of the mechanism of action of ewsr1-fli1 in the development of ewing sarcoma and may open new therapeutic options.