caractérisation fonctionnelle des mutations de stag2, tp53 dans le sarcome d’ewing

le sarcome d'ewing est une tumeur osseuse survenant principalement chez les adolescents et les jeunes adultes. génétiquement, elle se caractérise par des fusions entre le gène ews et un membre de la famille des facteurs de transcription ets, le plus souvent fli1. ews-fli1 est un facteur de transcription aberrant qui se lie à l'adn en des sites spécifiques de deux types : des répétitions microsatellites de type ggaa ou un site unique similaire à ceux de la famille ets. cela conduit à une régulation anormale de plusieurs centaines de gènes cibles. l'expression d’ews-fli1 est toxique dans la plupart des lignées cellulaires, elle est cependant tolérée dans les cellules souches mésenchymateuses (csm) dont elle induit la transformation maligne. ces cellules sont considérées comme étant à l'origine du sarcome d'ewing. de plus, la capacité transformante d’ews-fli1 dépend fortement de polymorphismes germinaux qui potentialisent ses propriétés de régulation transcriptionnelle. ces polymorphismes spécifiques pourraient en partie expliquer la prévalence du sarcome d’ewing dans certaines populations, notamment dans la population caucasienne. en dehors de la fusion ews-fli1, quelques autres anomalies génétiques récurrentes telles que des mutations inactivatrices de stag2, de tp53 ou de cdkn2a sont observées. nous souhaitons étudier le rôle de ces événements secondaires dans le cadre du sarcome d'ewing. un intérêt particulier sera porté au gène stag2 qui est non seulement la mutation secondaire la plus fréquente mais qui est également lié à un mauvais pronostic et qui peut apparaitre spécifiquement lors de la rechute. stag2 code pour une sous-unité du complexe de la cohésine qui est impliquée dans le maintien des chromatides sœurs et de leur ségrégation lors de la mitose ainsi que dans l'isolement de domaines de chromatine par l’intermédiaire de son interaction avec la protéine ctcf. des données contradictoires concernant le rôle de stag2 sur la stabilité du génome ont été publiées. dans le sarcome d'ewing, nous observons une association significative entre le nombre de variants structuraux et la présence d’une mutation stag2. cependant, comme il existe une forte association entre les mutations de stag2 et de tp53, on ignore encore laquelle de ces deux mutations (ou l'association des deux) est responsable de l’instabilité génomique. nous tenons à étudier l’effet fonctionnel de la perte de stag2 dans les cellules de sarcome d’ewing à la fois sur son potentiel impact sur la stabilité du génome, mais également sur sa probable implication dans des mécanismes de régulation épigénétique et d’expression génique. la technologie crispr, cas9 sera utilisée pour générer des lignées cellulaires de sarcome ewing isogéniques pour les mutations stag2 et tp53. des approches similaires seront utilisées pour récapituler la translocation entre ews et fli1 dans des csm dérivées de patients atteints de sarcome d’ewing. les polymorphismes, notamment liés au nombre de répétitions consécutives de ggaa (microsatellites), spécifiques du contexte de susceptibilité, pourraient potentialiser l’effet oncogénique d’ews-fli1. nous avons récemment démontré que ce mécanisme est fondamental à l’effet oncogénique du gène egr2 dans le sarcome d’ewing par la liaison d’ews-fli1 sur un microsatellite régulant egr2. des mutations de stag2 et tp53 seront par la suite introduites dans ces csm exprimant ews-fli1 afin de générer des lignées isogéniques mutantes. les caractéristiques de ces différentes lignées cellulaires isogéniques seront ensuite analysées. nous allons étudier 1) la prolifération, l'invasion et le potentiel tumorigène. 2) les dommages à l'adn et l'instabilité génomique induits lors de cassures double brin ou lors de stress réplicatifs. 3) l’expression génique ainsi que son profil épigénétique. une hypothèse majeure du projet est que la perte de fonction de stag2 pourrait interférer avec l’action transcriptionnelle d’ews-fli1 sur certains loci, notamment par une modification de la structure tridimensionnelle de la chromatine. des expériences de chip-seq pour les différents membres du complexe de cohésion, pour ctcf ainsi que pour des marques d’activation, répression majeures d'histone seront effectuées. la structure de la chromatine sera également étudiée par les techniques de chia-pet et d’atac-seq. au final, ce projet principalement axé autour des mutations stag2, tp53 devrait permettre de mieux comprendre leurs rôles dans le développement du sarcome d'ewing et de transposer ces résultats à d’autres tumeurs où stag2 est également muté. ce projet rassemble deux groupes de recherche ayant une expertise complémentaire dans la biologie du sarcome d'ewing et dans l’instabilité du génome ainsi que dans l’utilisation des techniques de type crispr, cas9 pour récapitulation de translocation dans des cellules normales.

ewing sarcoma is a primary bone tumour of adolescent and young adult. genetically, it is characterized by the fusion between the ews gene that encodes a rna binding protein and a member of the ets family of transcription factors, most frequently fli1. ews-fli1 is an aberrant transcription factors that binds to dna at specific sites, being either microsatellite ggaa repeats or classical ets binding motives, and consequently leads to abnormal regulation of a variety of downstream targets that mediate its oncogenic effects. while ews-fli1 expression is toxic in most cell lines, it is tolerated and transforming in mesenchymal stem cells, which is now considered as the cell-of-origin of ewing sarcoma. in addition, the transforming ability of ews-fli1 is highly dependent upon germline polymorphisms that potentiate its transcription regulation properties. such population-specific polymorphisms may account for the particular epidemiological profile of ewing sarcoma which is mainly observed in populations of european descent and much rarer in population of african descent. apart from the ews-ets fusion, few other recurrent genetic abnormalities are observed in ewing sarcoma. these mainly include inactivating mutations in stag2, tp53 and cdkn2a. in this project we wish to investigate the role of these secondary mutations in the development of ewing sarcoma. a particular interest will focus on stag2 which is the most frequent secondary mutation in ewing sarcoma and which was shown in some cases to occur only at relapse. stag2 encodes an integral component of the cohesin complex which is involved both in sister chromatin cohesion and in the insulation of chromatin domains through its interaction with ctcf. conflicting data has been published concerning its role in genetic stability. in ewing sarcoma we observe a significant association between the number of structural variants and the presence of a loss-of-function of stag2. however, as a strong association was observed between stag2 inactivation and tp53 mutation it is still unclear which of these two mutations (or the association of both) is responsible for genetic instability. we therefore wish to investigate stag2 loss-of-function in ewing cells and its impact on genome stability but also on the epigenetic regulation of gene expression. crispr, cas9 editing technologies will be used to generate isogenic ewing sarcoma cell lines with the most frequent types of secondary mutations in ewing sarcoma including stag2 and tp53. similar technologies will be used to join the ews and fli1 loci to create an ews-fli1 translocation in mesenchymal stem cells derived from ewing patients. starting with mscs from patients should ensure that the key polymorphisms that may potentiate ews-fli1 action are present as recently shown for egr2. these ews-fli1 expressing mscs will then also be engineered to harbour the most frequent secondary genetic alterations. we should thus construct a panel of ewing and msc cell lines in which the different combinations of secondary mutations observed in ewing sarcoma will be reconstituted. the priority will be to investigate stag2 effects in a tp53 wild type or mutant background. the characteristics of these different cell lines will then be investigated including 1) proliferation, invasion and tumorigenic potential 2) dna damage response and genomic instability upon induction of a double strand breaks or upon replicative stress 3) epigenetic and expression profiling. a major hypothesis of the project is that the loss-of-function of stag2 deletion may functionally interfere with ews-fli1 at some specific loci, through the modification of the 3d structure of the chromatin. chip-seq experiments will be performed with the different members of the cohesion complex, with ctcf, with major activating or repressive histone marks. the structure of chromatin will be also further investigated through chia-pet, atac-seq and targeted or genome-wide chromatin conformation capture experiments. as these mutations can be observed at the sub-clonal level in some tumours we will also have strong interest in performing in vivo experiments where labelled, isogenic cells with variable background of mutations will be co-injected in mice then followed over time to appreciate whether competition or cooperation between the different clones is observed. altogether, this project which is mainly focused on stag2 mutation should enable to better understand its role in ewing sarcoma. if possible in the time frame of the project it would also be interesting to explore cdkn2a as we have shown that stag2 and cdkn2a inactivation are mutually exclusive in ewing sarcoma. this study may unravel functions of stag2 that may also account for its tumor suppressor role in a variety of other malignancies. the project gathers two research groups with complementary expertise in ewing sarcoma biology, in genome instability and in editing technologies.