etude des mécanismes de remodelage de la chromatine altérés dans les sarcomes à petites cellules rondes

le remodelage de la chromatine, mécanisme par lequel la condensation, décondensation de l'adn est réalisée, joue un rôle crucial dans la régulation de la transcription en modifiant l'architecture des nucléosomes permettant ainsi d’exposer ou de masquer l'adn génomique à la machinerie de transcription. ce mécanisme met en jeu la modification covalente d’histones, la méthylation de régions spécifiques de l'adn génomique, l'incorporation d’histones variantes ou le déplacement de nucléosomes. plusieurs complexes de remodelage de la chromatine ont été identifiés parmi lesquels les complexes répressifs polycomb (ou prc) et les complexes swi, snf impliqués dans la compaction et décompaction de la chromatine, respectivement. les sarcomes à petites cellules rondes (spcr) consistent en un groupe hétérogène de tumeurs dont la plupart présente un gène de fusion pathognomonique tel que ewsr1-ets dans le sarcome d'ewing, ewsr1-wt1 dans la tumeur desmoplastique à petites cellules rondes, ss18-ssx dans le sarcome synovial ou encore pax-foxo1 dans le rhabdomyosarcome alvéolaire. depuis moins d'une décennie, de nouvelles entités de spcr ont été identifiées grâce au séquençage massif. c’est le cas des tumeurs présentant les gènes de fusions cic-dux4 et bcor-ccnb3, ressemblant aux sarcomes d’ewing, ou encore des sarcomes thoraciques smarca4-déficients (smarca4-dts) qui sont extraordinairement semblables aux carcinomes hypercalcémiant à petites cellules de l'ovaire (sccoht). les analyses des profils d’expression de ces nouvelles entités de spcr indiquent que les processus de remodelage de la chromatine pourraient être perturbés par leur évènement oncogénique respectif. les mécanismes de remodelage de la chromatine sont retrouvés altérés dans un nombre croissant de pathologies cancéreuses, mais jusqu'à présent et à l'exception de rares pathologies comme les tumeurs rhabdoïdes malignes et les sarcomes synoviaux, ces perturbations n’ont pas été étudiées dans les spcr. c’est tout l'objectif du présent projet. ainsi, au cours de ce projet, nous allons explorer les interactions possibles entre les protéines de fusion cic-dux4 ou bcor-ccnb3 et les complexes prc et, ou swi, snf, et étudier la structure du complexe swi, snf en l'absence de brg1 et brm, observée dans les smarca4-dts et les sccoht. pour atteindre nos objectifs, nous utiliserons les modèles cellulaires disponibles, une lignée cellulaire cic-dux4 et de deux lignées cellulaires dérivées de sccoht, et développerons des modèles cellulaires des tumeurs bcor-ccnb3 et smarca4-dts, en utilisant soit des xénogreffes sur souris dérivées de tumeurs de patients (pdx) soit des modèles de poissons zèbre transgéniques, grâce à la collaboration avec le laboratoire de james amatruda à dallas. a partir de ces lignées cellulaires, nous réaliserons des co-immunoprécipitations (co-ip) par les protéines de fusion ou les membres des complexes de remodelage de la chromatine, permettant l’identification des protéines associées. la validation de ces interactions sur des échantillons de tumeurs de patients se fera en utilisant des tests de ligation de proximité (proximity ligation assay), qui permettent la détection par immunofluorescence de protéines physiquement très proches. la composition en sous-unités de ces complexes sera étudiée, en présence ou absence des évènements oncogéniques, par spectrométrie de masse ou immunoblot après co-immunoprécipitation des complexes endogènes associés à la protéine de fusion, purification par affinité en utilisant des anticorps swi, snf spécifiques ou fractionnement sur gradient de glycérol. l'identification des locus génomiques les plus touchés par ces perturbations sera effectuée en utilisant différentes approches (épi)génétiques (chip-seq, medip-seq, arn-seq). le chip-seq nous permettra de déterminer l'emplacement précis sur l'adn des protéines de fusion ainsi que ceux des complexes prc et swi, snf. les chip-seq nous permettront de corréler les marques h3k27me3, h3k36me2, h2k27ac, h3k4me3 et h2ak119ub1 avec la fixation des différents complexes au niveau de gènes précis, pour lesquels les niveaux d'expression seront évalués par rna-seq. enfin, nous étudierons l'impact de la ré-expression de smarca4 dans smarca4-dts, sccoht et l’inactivation de bcor-ccnb3 et cic-dux4 sur la composition des différents complexes, leurs activités transcriptionnelles (grâce à l’utilisation de gènes modèles) ainsi que sur des mécanismes plus généraux tels que la prolifération cellulaire et l’apoptose. au total, nous proposons d'étudier quatre entités de sarcomes à petites des cellules rondes, de la mise en place des modèles cellulaires pertinents et jusqu'aux analyses complètes des perturbations engendrées par les événements oncogéniques sur les mécanismes de remodelage de la chromatine.

chromatin remodeling, the mechanism by which compaction, de-condensation of dna is achieved, plays a crucial role in regulation of transcription by altering nucleosome architecture thus exposing or hiding genomic dna to transcription machinery. this might happen through covalent modifications of histones, methylation of specific genomic dna regions, incorporation of variant histones or displacement of nucleosomes. several chromatin remodeling complexes have been identified among which the polycomb repressive complexes (prcs), involved in chromatin compaction and responsible for some repressive covalent modifications of histones, and the swi, snf complexes, involved in chromatin de-compaction that disrupts the contacts between dna and histones in an atp-dependent mechanism. small round cell sarcomas (srcs) consist in a heterogeneous group of tumors affecting mostly children and young adults. most srcs entities are characterized by the presence of a pathognomonic fusion gene such as ewsr1-ets fusions in ewing sarcoma, ewsr1-wt1 in desmoplastic small round cell tumors, ss18-ssx fusions in synovial sarcoma or pax-foxo1 fusions in alveolar rhabdomyosarcomas. since less than a decade, new srcs entities have been described like cic-dux4- and bcor-ccnb3-positive tumors, resembling ewing sarcomas, and smarca4-deficient thoracic sarcoma (smarca4-dts), which are extraordinarily similar to the small cell carcinoma of the ovary, hypercalcemic type (sccoht). expression profiling analyses of these new srcs entities showed that chromatin remodeling processes might be disturbed by their respective oncogenic event. chromatin remodeling mechanisms are found frequently altered in a growing number of cancerous pathology, but up to now and at the exception of very few pathologies (like the malignant rhabdoid tumors and synovial sarcomas), perturbations of this process have not been thoroughly investigated in srcs. deep investigation of chromatin remodeling processes in these srcs is the objective of the present project. in this project, we will explore the possible interaction between cic-dux4 or bcor-ccnb3 fusion proteins and prc and, or swi, snf complexes and study the structure of swi, snf complex in absence of both brg1 and brm. to achieve our goals we will use available cellular models, one cic-dux4 tumors cell line and two cell lines derived from sccoht tumors, and we will develop cellular model for bcor-ccnb3 and smarca4-dts pathologies using both patient derived mouse xenografts (pdx) and transgenic zebrafish, thanks to a collaboration with the laboratory of james amatruda in dallas. using these cell lines, we plan to perform co-immunoprecipitations (co-ip) of the fusion protein or of a complex member and identify the associated proteins, with a special focus on chromatin remodeling complex member. validations of these interactions on patient tumors samples will be achieved using proximity ligation assays. we will determine the subunits composition of these complexes, and their perturbation by the fusion proteins, using mass spectrometry or western blotting analyses following either co-immunoprecipitation of endogenous complex associated to the fusion protein, affinity purification using specific swi, snf antibodies or glycerol gradient fractionation. the identification of the genomic loci the most impacted by these perturbations using different (epi-)genetic approaches (chip-seq, medip-seq, rna-seq) will be performed. chip-sequencing will allow us to determine the precise location on dna of the fusion proteins as well as the prc and swi, snf complexes. chip-seq will allow us to correlate h3k27me3, h3k36me2, h2k27ac, h3k4me3 and h2ak119ub1 with the fixation of the different complexes on precise genes, for which rnaseq will assesses the expression level. finally, we will investigate the impact of the re-expression of smarca4 in smarca4-dts, sccoht tumors and the depletion of bcor-ccnb3 and cic-dux4 on the composition of the different complexes, their transcriptional activities (using gene models) as well as on some cellular processes like cell proliferation, apoptosis or migration, invasion. altogether we propose to investigate four entities of small round cell sarcomas, starting from the establishment of the relevant cellular models and up to the comprehensive analyses of chromatin remodeling perturbation operated by the oncogenic event.