pluripotence des cellules d'origine des tumeurs rhabdoïdes : modélisation animale et rôles de ezh2, tet1 et dnmt3b dans le maintien de la pluripotence

les tumeurs rhabdoïdes sont des tumeurs agressives du nourrisson, caractérisées par une morphologie très indifférenciée, un jeune âge de survenue (âge médian de 18 mois) et une mortalité élevée. ces tumeurs peuvent se développer au dépens du cerveau (elles sont alors dénommées at, rt), du rein ou de diverses parties molles - dans toutes ces localisations, elles sont dues à l’inactivation biallélique du gène suppresseur de tumeur smarcb1, unique altération génétique observée. les cellules d’origine en sont inconnues mais plusieurs études suggèrent que les cellules rhabdoïdes ont des caractéristiques de cellules souches embryonnaires. par inactivation conditionnelle de smarcb1 chez la souris, nous avons récemment démontré que des tumeurs cérébrales surviennent rapidement et avec une grande fréquence seulement lorsque le gène est invalidé à des étapes très précoces du développement embryonnaire (e6 à e10). néanmoins, notre modèle utilisant un système d’inactivation ubiquitaire, nous n’avons pas formellement identifié les cellules d’origine de ces tumeurs. l’analyse du transcriptome de tumeurs rhabdoïdes humaines comparées à d’autres tumeurs déficientes pour smarcb1 a aussi révélé une signature « cellule souche embryonnaire » pour les tumeurs rhabdoïdes. en particulier, nous avons observé une hyperexpression spécifique de deux gènes intervenant de façon antagoniste dans l’établissement de la méthylation de l’adn, à savoir tet1 et dnmt3b. par ailleurs, une fonction excessive du complexe polycomb (prc2) est un effet attendu de la perte de fonction de smarcb1 au sein du complexe swi, snf. au total, les tumeurs rhabdoïdes présentent des caractéristiques de cellules souches embryonnaires, cohérentes avec l’hypothèse d’un maintien de l’indifférenciation par une action répressive excessive de prc2, dans un contexte d’hyperexpression de gènes régulant l’établissement de la méthylation aux étapes très précoces de la différenciation des cellules embryonnaires. notre projet a donc pour but 1) de générer un nouveau modèle de tumeur rhabdoïde cérébrale en ciblant plus spécifiquement des cellules souches et progéniteurs neuronaux précoces - ce modèle sera à la fois informatif sur l’oncogenèse de ces tumeurs et leurs cellules d’origine, et utile en thérapeutique préclinique, 2) d’étudier les effets de l’inhibition pharmacologique de ezh2 (membre de prc2) sur des xénogreffes de tumeurs primaires humaines, ou sur les tumeurs issues de notre modèle génétiquement modifié - nous étudierons particulièrement les programmes de différenciation par analyse des transcriptomes et la nouvelle cartographie des enhancers actifs (h3k27ac) et des promoteurs réprimés (h3k27me3), 3) d’étudier le profil de méthylation précis des tumeurs rhabdoïdes, en particulier par rapport à d’autres tumeurs smarcb1 déficientes, afin de mieux appréhender l’impact réel de l’hyperexpression des gènes tet1 et dnmt3b dans l’oncogenèse des tumeurs rhabdoïdes.

rts (rt) are aggressive cancers of infancy, characterized by undifferentiated morphology and early onset (median age, 18months). these tumors are genetically stable, apart from the biallelic inactivation of smarcb1 tumor suppressor gene. the cells of origin are still unknown, but embryonic stem cells or progenitors have been proposed as candidates. by conditional inactivation of smarcb1 in mice, we have recently developed the first model of rt of the central nervous system (at, rt). at, rt developed only when smarcb1 was deleted at early developmental stages (e6 to e10), supporting the hypothesis of stem cells, early progenitor as cells of origin. however, the ubiquitous system we used precludes the formal demonstration of this hypothesis. furthermore, transcriptome analyses of human rts also revealed some embryonic stem cell features specific for rts among smarcb1-deficient cancers. this signature also comprised an over expression of genes involved in the de novo methylation (dntm3b) and methylation including the imprinting erasure (tet1), physiologically active in germ cells and embryonic stem cells. physiologically, the regulation of dna methylation in germ cells and early embryonic cells is tightly linked to the activity of the prc2 complex, which methylates histone h3 in k27 through ezh2 catalytic activity. the known antagonism between swi, snf complex (to which smarcb1 belongs) and prc2 is thought to result in an abnormal repression of differentiating programs. in the present project, we hypothesize that rts arise from embryonic stem cells in which prc2 repression is overwhelming in a specific methylation landscape. we aim at demonstrating this by i) developing a new mouse model, targeting ascl1 expressing neural progenitors- we will thereby demonstrate the cell of origin of at least a subset of at, rt, and further argue in favor of a restricted developmental window required for at, rt to develop, ii) studying the main epigenetic effects of ezh2 in vivo inhibition on rts- chip-seq will be performed, using repressive and activating marks on the chromatin, and the impact on differentiation programs will be studied iii) addressing the roles of tet1 and dnmt3b methylating, demethylating proteins specifically in rts- we’ll describe the exact methylation pattern of rts and assess the functional consequences of tet1 and dnmt3b dysregulation in smarcb1-deficient cell lines.