modélisation des leucémies à mégacaryoblastes de la trisomie 21

les enfants trisomiques 21 (syndrome de down, ds) ont un risque élevé de développer des leucémies mégacaryoblastiques (lam7). 20 % des fœtus trisomiques naissent avec un syndrome nommé tmd (transient myeloproliferative disorder) qui régresse spontanément. cependant, plus de 10 % des enfants développeront une lam7. ce processus multi-étapes est associé à l’acquisition séquentielle d’évènements génétiques. le stade tmd est caractérisé par une mutation acquise clonale de gata1 aboutissant à l’expression d’une forme tronquée (gata1s) dépourvue de son domaine de transactivation amino-terminal. dans les lam7, des études génétiques ont permis d’identifier, en plus de la trisomie et de gata1s, des altérations affectant des gènes de signalisation (mpl, jak2), de régulateurs épigénétiques (ezh2) ou surtout des membres du complexe cohésine (rad21, stag2). utilisant un modèle murin partiellement trisomique, nous avons reproduit in vivo l’acquisition progressive de ces altérations, et identifié le gène trisomique dyrk1a comme important dans le développement des ds-lam7. cependant ce modèle murin ne reproduit pas complètement la pathologie humaine car le modèle transgénique utilisé ne présente qu’une trisomie partielle. de plus, nous n’avons pas pu caractériser les mécanismes de prédisposition qui transforment un précurseur mégacaryocytaire fœtal et les mécanismes moléculaires associés à la progression vers des lam7 restent inconnus. c’est pourquoi, la modélisation du développement de ces lam7 dans un contexte humain embryonnaire, fœtal nous semble majeur en vue d’identifier ces mécanismes de prédisposition et de progression. pour ces raisons, nous utiliserons le modèle d’ipsc trisomiques puisque leur engagement, prolifération et différenciation sont contrôlables in vitro. ces cellules représentent une plateforme expérimentale de premier choix pour modifier le génome et en évaluer les conséquences. ainsi, notre projet s’articule autour de 3 axes : 1 - reproduire la pathologie humaine nous disposons de lignées ipsc trisomiques 21 et euploïdes contrôles. nous avons mis au point différents protocoles expérimentaux permettant leur différenciation dans l’ensemble des lignées myéloïdes in vitro. dans un premier temps, nous allons étudier les différences phénotypiques, cinétiques et moléculaires entre ipsc euploïdes et trisomiques. dans un second temps, nous allons reproduire l’acquisition successive des altérations génétiques dans ces ipsc par différentes stratégies. brièvement, a) nous utilisons actuellement gata1s-er introduit par la technique des zinc finger nucléases qui permet de contrôler l’induction de gata1s - b) nous réalisons un « knock-in » du mutant mplw515l ou une surexpression d’un mutant de la calr, del52 - c) les mutations pertes de fonction des gènes codant les cohésines seront reproduites par arn interférence et d) le complexe prc2 (ezh2) sera inhibé pharmacologiquement. l’analyse précise des caractéristiques phénotypiques et cellulaires altérées par l’ajout de chaque événement permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de coopération qui conduisent à l’établissement des ds-lam7. 2 - caractériser des gènes trisomiques à effet de dosage par une approche de gène candidat, nous allons d’abord vérifier dans les ipsc trisomiques, pré-leucémiques (trisomie + gata1s) et leucémiques (trisomie + gata1s + autres évènements génétiques), l’impact fonctionnel de gènes trisomiques d’intérêt dont dyrk1a dans la différenciation mégacaryocytaire et le développement des ds-lam7 par des approches d’arn interférence ou crispr, cas9 (outils expérimentaux déjà validés). de plus, nous allons étendre cette étude à l’identification de nouveaux gènes à effet de dosage. la technologie crispr, cas9 sera utilisée pour « découper » le chromosome 21 en 6 régions génomiques afin de mesurer l’implication des gènes qu’elles contiennent. les gènes candidats retenus feront l’objet d’une étude plus approfondie pour rechercher les mécanismes moléculaires mis en jeu. 3 - caractériser les mécanismes moléculaires de la coopération oncogénique dans les ds-lam7 a chaque étape de la progression tumorale, nous analyserons le profil trancriptionnel qui différencie les cellules trisomiques des cellules euploïdes. les marques épigénétiques ainsi que des composantes structurelles du génome seront également analysées. en parallèle, nous identifierons les partenaires protéiques différentiels entre gata1 et gata1s par une approche globale ip-ms réalisée dans des lignées cellulaires génétiquement modifiées et vérifierons leur relevance. en reproduisant le processus multi-étapes connu dans les ds-lam7, nous pensons identifier de nouveaux mécanismes moléculaires de coopération entre altérations acquises et trisomie 21. notre étude devrait avoir un intérêt général en oncogenèse, en particulier dans la compréhension du rôle initiateur de la trisomie 21 dans le développement d’un processus malin.

down syndrome (ds) children (constitutive trisomy 21) exhibit a high risk to develop acute megakaryoblastic leukemia (amkl). 20% trisomic neonates develop a transient myeloproliferative disorder (tmd), which spontaneously regresses around birth. more than 10% of ds neonates that had tmd will develop a myelodysplastic syndrome or an amkl before 4 years of age. this multi-step oncogenic process has been associated with a sequential acquisition of genetic alterations. in virtually all tmd and ds-amkl samples, acquired mutations in the gata1 gene are observed- these mutations lead to the expression of a shorter truncated form of gata1 named gata1s. in amkl blasts, several other secondary mutations are acquired in genes encoding: 1) signaling effectors (mpl, jak2), 2) cohesin complex components (rad21, stag2) and 3) epigenetic regulators (ezh2). we recently reproduced this multi-step pathogenesis by introducing gata1s and mpl mutant in trisomic murine cells. using an shrna screening approach, in this system, we identified dyrk1a as one of the most prominent trisomic genes implicated in ds-amkl development. however, the murine model we used was only partially trisomic, and did not allow us to fully characterize the molecular mechanisms implicated in leukemia initiation at the level of an embryonic, fetal mk progenitor and in the progression from tmd toward the full-blown ds-amkl. thus, it appears crucial to model ds-amkl from an embryonic, fetal context. we reasoned that human trisomic ipsc would be a suitable model since their engagement, specification and hematopoietic differentiation can be controlled in vitro. therefore, we will use cutting-edge strategies to better understand the functional impact of trisomy 21 in cooperation with the acquired genetic alterations described in human ds-amkl blasts. with the goal of unravelling the initiation and progression mechanisms, we will focus our project on three specific aims: 1 - reproduce ds-amkl development we recently obtained two trisomic and two control diploid ipsc lines. first, we will study their phenotypic, kinetic and molecular differences during hematopoietic specification and megakaryocytic differentiation using different protocols commonly used in our laboratory. next, we will reproduce the multistep pathogenesis of ds-amkl development by adding sequentially the different genetic events into ipsc using already validated strategies. briefly, 1) we will introduce a tamoxifen inducible estrogen (er)-tagged version of gata1 (gata1s-er), 2) we will perform a « knock-in » of the mutant mplw515l or, alternatively overexpress calr, del52 mutant ectopically to constitutively activate the jak, stat pathway as observed in ds-amkl samples- 3) loss of function mutations of gene encoding cohesin components will be mimicked via rna interference- and 4) the prc2 (ezh2) will be pharmacologically inhibited. the precise characterization of megakaryocytic phenotype following the addition of each genetic event will allow us to better understand how embryonic, fetal hematopoietic progenitors become progressively transformed. 2 - characterization of trisomic genes with a gene dosage effect we will first investigate the role of candidate trisomic genes in ds-amkl predisposition and progression using the different ipsc systems established in aim 1: predisposition, initiation (trisomy alone), preleukemia (trisomy + gata1s) and full blown leukemia (trisomy + gata1s + mplw515l + shrad21 +, - ezh2 inhibition). the role of our first trisomic candidate gene dyrk1a will be assessed using crispr, cas9 genome editing strategy and pharmacologic inhibition. next, in order to identify new trisomic genes with gene dosage effects, we will use the crispr, cas9 technology to cut the chromosome 21 in 6 regions to establish isogenic clones that are partially trisomic. thus, we expect to identify new trisomic candidate genes that will be assessed in more details. 3 - characterization of the molecular mechanisms of oncogenic cooperation in ds-amkl from both aim 1 and 2, we will analyse the transcriptional differences between trisomic and diploid cells at each step of leukemic progression. moreover, the main histone marks and genome structural components will be also assessed. in parallel, using genetically modified cell lines, we will identify the differential protein partners between gata1 and gata1s by a proteomic global using an immunocapture technique called ip-ms and will investigate their relevance in the trisomic, preleukemic and leukemic ipsc models. by modeling this multi-step process responsible of ds-amkl, we believe that we will identify new molecular mechanisms of cooperation between acquired somatic mutations and the trisomy 21. in addition, our work should have a general interest in leukemogenesis and oncogenesis by defining the precise role of an initiating event (here trisomy 21) and the development of a full malignant disorder.