rôles de egr2 dans le cancer et au cours du développement

le sarcome d’ewing (se) est la deuxième tumeur primitive de l’os chez l’enfant. cette tumeur est caractérisée génétiquement par la présence d’une translocation chromosomique spécifique aboutissant à une protéine chimérique entre ews et une protéine de la famille ets, le plus souvent fli1. bien que la fusion ews, fli1 soit clairement oncogène, son expression est toxique dans la plupart des systèmes cellulaires suggérant qu’ews, fli1 exerce son action oncogène dans un contexte particulier qui associe potentiellement trois éléments clefs : l’environnement d’une cellule d’origine spécifique, l’interaction avec d’autres altérations somatiques du génome et un contexte génétique constitutionnel singulier. ces différents éléments généreraient un milieu permissif permettant ainsi une expression non-toxique d’ews, fli1 et l’initiation tumorale. la recherche d’altérations génétiques et épigénétiques associées est réalisée dans le cadre d’un projet de séquençage des adns et arns tumoraux icgc soutenu par l’inca. l’hypothèse d’une influence du contexte génétique constitutionnel est soutenue par les études épidémiologiques qui montrent que l’incidence du se est très prédominante dans les populations d’origine européenne. pour explorer cet aspect épidémiologique, nous avons récemment conduit une étude d’association de type gwas qui a permis d’identifier trois régions du génome qui présentent une association très significative avec la survenue d’un se et des odds ratios >2, exceptionnellement hauts, au sein des études gwas de cancers. les chromosomes 1, 10 et 15 ainsi identifiées codent pour des gènes qui semblent très pertinents dans le cadre du se. nous souhaitons analyser plus particulièrement la région du chromosome 10 et en particulier le gène egr2, krox20. en effet, ce gène est très fortement surexprimé dans les se ou il constitue une cible d’aval de ews, fli1. les variants associés au se sont corrélés à un niveau d’expression accrue de egr2 (eqtl). par ailleurs les études fonctionnelles préliminaires montrent que l’inhibition de l’expression de egr2 réduit considérablement la prolifération et la clonogénicité des cellules de se et est associée à des modifications transcriptionnelles de gènes impliqués dans le cycle cellulaire et la survie cellulaire. enfin egr2 est un facteur de transcription impliqué dans la prolifération et la différentiation de cellules variées et en particulier les progéniteurs osseux qui constituent potentiellement la cellule d’origine des se. au total ces données suggèrent que egr2 présente un rôle essentiel pour le développement des se. un séquençage complet de la région egr2 réalisée chez des patients atteints de se et chez des cas contrôles a permis de dresser le catalogue des variants de cette région. actuellement, en collaboration avec le groupe de patrick charnay, expert de la régulation d’egr2 au cours du développement chez la souris et le poisson zèbre, nous examinons les données de séquençage à la recherche de variants susceptibles de modifier des sites de liaison et de régulation connues et, ou d’en créer de nouveaux. en effet la régulation d’egr2 est complexe et contrôlée par de nombreux éléments qui agissent en cis, par des boucles de régulation positives et négatives. par ailleurs la région contient plusieurs éléments, en particulier des répétitions ggaa qui constituent des éléments susceptibles d’être liés et régulés par ews, fli1. ces différents éléments seront étudiés par des systèmes rapporteurs dans différents systèmes cellulaires. les analyses préliminaires des gènes associés à l’expression d’ egr2 montrent qu’egr2 est impliqué dans la signalisation fgf. en accord avec cette hypothèse, les antagonistes de cette signalisation réduisent considérablement la prolifération et la clonogénicité des cellules de se. plusieurs éléments en cis d’egr2 sont régulés par le fgf. par ailleurs ews, fli1 est un fort régulateur négatif de sprouty, un puissant régulateur négatif de la voie fgf. ces différents éléments suggèrent que les effets combinés des variants constitutionnels associés au sarcome d’ewing et les effets transcriptionnels d’ews, fli1 aboutissent à une hyper-activation de la signalisation pro-proliférative du fgf dont le ciblage pourrait constituer une alternative thérapeutique importante. enfin, la régulation de l’egr2 sera étudiée dans les modèles murins et du poisson zèbre. au total ce projet permettra de préciser dans quelle mesure l’interaction entre les effets des variants constitutionnels et ceux d’ews, fli1 pourraient contribuer à la tolérance à l’expression d’ews, fli1 dans les cellules souches mésenchymateuses d’individus porteurs d’une susceptibilité génétique et ainsi contribuer au développement tumoral. les importantes données préliminaires obtenues sur egr2 nous amènent à nous concentrer sur ce gène. cependant, plusieurs analyses globales réalisées dans ce cadre permettront également de préciser le rôle des régions associées sur les chromosomes 1 et 15.

ewing’s sarcoma (es) constitutes the second most common primary bone malignancy in children. genetically, es are characterized by fusion oncogenes involving the ews and fli1 gene or another ets transcription factor. despite its action as an oncogene in es, ews, fli1 expression is toxic to most normal cells, suggesting that ews, fli1 exerts its oncogenic action in a specific context that may associate the background of a specific cell of origin, the interaction with other genetic alterations and, or a specific germline genetic background altogether creating a “permissive milieu” for non-toxic ews, fli1 expression and thus es establishment. the search for associated genetic and epigenetic somatic abnormalities is investigated using whole-genome dna and rna sequencing and epigenetic profiling within an icgc project funded by inca. the hypothesis of the influence of a germline genetic contribution is supported by epidemiological studies that have for long pointed out a considerable predominance of es in populations of european descent. to explore this aspect, we recently conducted a genome-wide association study (gwas) in es that identified three highly significant loci with odds ratios >2, which is exceptionally high among cancer gwas. the chromosome 1, 10, and 15 regions that were identified by the gwas encode genes that are highly relevant to es biology. in this project we will more specifically analyze the contribution of the chr10 locus and particularly of the early growth response 2 gene (egr2 also known as krox20) gene to es. indeed, egr2 is not only massively over-expressed in es but is a downstream target of ews, fli1. moreover, es-associated variants exhibit strong expression quantitative trait loci (eqtl) properties, as at-risk alleles show very significant correlation with egr2 expression. in addition, the knockdown of egr2 significantly reduces proliferation and clonogenicity of es cells, which is associated with transcriptional changes in cell-cycle regulators and pro-survival genes. egr2 is a conserved zinc-finger transcription factor involved in proliferation and differentiation of various cell types and particularly osteoprogenitors that may constitute the cell of origin of es. collectively, these data suggest that egr2 has an essential role in the development of es. as most gwas snps are usually not the causative variants but are likely to be linked with such variants, comprehensive sequencing of the egr2 locus was performed to seek for causative variants that contribute to egr2 overexpression. we sequenced the gwas loci in 449 cases, 255 controls and 20 es cell lines. presently, in collaboration with the group of patrick charnay who is an expert in egr2 regulation during mouse and zebrafish development, we are scrutinizing the next-generation sequencing data to identify potentially causative variants that modify existing or generate de novo regulatory elements. the complex regulation of egr2 is controlled by multiple conserved cis-acting regulatory elements, as well as positive and negative feedback loops, which are currently investigated in depth by the charnay’s group. regulatory elements modified by es-associated variants and potentially polymorphic ggaa-microsatellites, which constitute known elements to be bound and regulated by ews, fli1, will be investigated in reporter systems. gene-set enrichment analysis of egr2-coexpressed genes in primary es revealed that egr2 is linked to the fgf pathway. indeed, es express fgfrs and fgf strongly induces egr2 in a time- and dose-dependent manner. conversely, fgfr antagonists inhibit egr2 expression and reduce proliferation and clonogenicity of es cells. consistently, several of the cis-acting elements governing egr2 expression are fgf-inducible. importantly, ews, fli1 almost completely abolishes the expression of sprouty1 (spry1) - a potent negative-feedback upstream inhibitor of fgfr signaling. together these data suggest that egr2 is a major player in es. its overexpression in this tumor may result both from germline variations and from transcriptional effects of the ews, fli1 fusion oncogene. it may account for a strong activation of the pro-proliferative fgfr signaling cascade whose targeting may constitute an attractive therapeutic option. finally, egr2 regulation and role will be investigated in zebrafish and mouse systems. the complex regulatory, transcriptional and functional interplay of egr2 and ews, fli1 may contribute to the non-toxic expression of ews, fli1 in mesenchymal stem cells of predisposed individuals. given the strong genetic and functional data that we already have on the egr2 locus we therefore wish to concentrate on this locus as a follow-up of the gwas. however, several global analyses performed in the frame of this project may also assess the contributions of the chr1 and chr15 loci.