recherche des facteurs clés responsables de la résorption osseuse associée au sarcome d’ewing

le sarcome d'ewing (se), deuxième tumeur osseuse la plus fréquente chez les adolescents et jeunes adultes, se caractérise dans la plupart des cas par ews-fli1, une protéine chimérique se comportant comme un régulateur transcriptionnel aberrant. l’une des principales caractéristiques pathologiques des se est une destruction osseuse importante. s’il est admis que la tumeur provenant de cellules souches mésenchymateuses (csm) de moelle osseuse envahit les tissus mous environnant en détruisant la matrice osseuse, les mécanismes précis qui contribuent à cette ostéolyse sont inconnus. toutefois, la résorption osseuse induite par la tumeur permet la libération de facteurs de croissance stockés dans la matrice osseuse favorisant, dans un cercle vicieux, la prolifération tumorale. l’objectif principal de notre projet est d'étudier dans les se les communications entre cellules tumorales et osseuses conduisant à la résorption osseuse. pour ce faire, nous utiliserons à la fois des modèles in vivo bien établis de xénogreffes orthotopiques ainsi que des approches innovantes in vitro de co-cultures en 3d. par ailleurs, nous avons de nouvelles opportunités pour le développement d’un modèle de souris transgénique de se. ainsi, dans ce projet nous proposons : 1) d’analyser les mécanismes régulateurs de la résorption osseuse dans le se en utilisant des modèles de xénogreffe de souris. nous avions déjà injecté des cellules de se dans le muscle tibial antérieur de souris et comparé les profils d'expression de tumeurs « précoces » ne montrant pas de destruction osseuse (10 jours post-injection) avec des tumeurs « tardives » présentant une résorption osseuse sévère (30 jours post-injection). cette analyse a conduit à l'identification de centaines de gènes différentiellement exprimés. grâce à ce résultat préliminaire, nous voulons poursuivre l’étude sur plusieurs autres lignées de cellules d'ewing dans le but d'identifier les gènes communs importants et corrélés à la résorption osseuse. 2) de développer in vitro des modèles de co-culture en 2d et 3d pour étudier l'effet des cellules de se sur la différenciation ostéoclastique. a côté d’un système 2d de co-culture de cellules tumorales avec des progéniteurs ostéoclastiques ensemencés sur une couche de dentine, un modèle innovant de culture en 3d imitant l'architecture osseuse sera utilisé. ce modèle 3d nécessitera la différentiation de csm, permettant la minéralisation de la matrice, laquelle sera dégradée dans une seconde étape par des pré-ostéoclastes activés par les cellules d'ewing. ces deux modèles in vitro nous permettront d’étudier les communications entre tumeur et cellules osseuses et d’identifier quels messagers sont échangés (et comment) entre les différents types cellulaires. les facteurs sécrétés activant la différenciation des ostéoclastes (tels que rankl ou il6) seront particulièrement étudiés. nous porterons également une attention particulière aux microvésicules tumorales, modulateurs du microenvironnement tumoral par transfert de molécules. en particulier, il sera intéressant de mettre en évidence un éventuel transfert d’ews-fli1 entre cellules tumorales et osseuses et d’étudier le rôle de celui-ci dans ce nouveau contexte cellulaire. 3) d'étudier fonctionnellement les gènes identifiés in vitro et in vivo en les inhibant (par si-ou shrna) ou en les ré-exprimant (transfert de gènes). la croissance tumorale ou cellulaire et le développement de l'ostéolyse ou destruction de la matrice seront mesurés dans les modèles in vivo et in vitro, respectivement. un des buts de ce projet est d'identifier des gènes « droguables » activés lors de la résorption. la validation de drogues lors d’essai préclinique pourra être entreprise mais est en dehors de l’objectif de ce projet. 4) d’établir un nouveau modèle de souris transgénique de se. a cet effet, nous collaborerons avec le laboratoire d’investigation préclinique de l'institut curie afin soit d’établir un nouveau modèle murin dont l’expression d’ews-fli1 sera régulée spatio-temporellement, soit d’améliorer un modèle existant de souris qui porte un transgène ews-fli1 « loxé » par croisement avec une souris portant une cre-ert spécifique. de par nos collaborations précédentes, nous savons que le blocage de la résorption osseuse est une option pertinente pour une nouvelle approche thérapeutique du se. le projet repose sur de solides bases scientifiques et utilisera des outils innovants pour disséquer les mécanismes de la résorption osseuse dans le se et tester de nouvelles hypothèses. les résultats attendus sont l’identification de gènes ou voies de signalisation clés impliqués dans la résorption osseuse associée au se ainsi qu’une possible identification de nouveaux médicaments altérant la croissance tumorale. par ailleurs, le modèle de souris transgénique et le développement d'un modèle 3d de co-culture in vitro seront tous deux d'une importance primordiale pour la communauté scientifique travaillant autour du sarcome d'ewing.

ewing sarcoma (es), the second most frequent bone tumor in adolescent and young adult, is characterized -in most cases- by the chimeric protein ews-fli1 that behaves as an aberrant transcription regulator. a major pathological feature of es is bone destruction, the bone lesion being lytic with large area of osteonecrosis. if it is thought that the tumor, arising from bone marrow mesenchymal stem cells, invades surrounding soft tissues by destroying the bone matrix, the precise mechanisms that contribute to this osteolysis are unknown. nevertheless, invasion of bone tissue by tumor cells early affects the balance between bone resorption and bone formation and tumor-driven increased bone resorption favors the release of growth factors stored in the bone matrix to further enhance tumor proliferation in a vicious cycle. the main objective of our project is to investigate the communications between tumor and bone cells leading to the bone resorption observed in ewing tumors. for this purpose we will use both well-established in vivo orthotopic xenograft mouse models as well as innovative in vitro approaches. moreover, we also have new opportunities to develop a more relevant transgenic mouse model of ewing sarcoma that is still a tremendous lack for the ewing sarcoma research community. in this project we propose: 1) to analyze bone resorption using xenograft mouse models. as a demonstration of cell adaptation during tumor development, we previously injected es cells into the anterior tibial muscle of mice and compared expression profiles of “early” tumors (10 days post-injection) demonstrating no bone destruction with “late” tumors (30 days post-injection) harboring severe bone resorption. expression pattern analyses led to the identification of hundreds of genes differentially expressed. with this preliminary result in hand, we want to pursue the experiment with several other ewing cell lines in order to identify common and important genes correlated to bone resorption. 2) to develop in vitro co-culture models both in 2d and 3d to study the effect of es cells on osteoclast differentiation. beside 2d systems of tumor cells co-cultured with osteoclast progenitors plated on dentin slice, innovative in vitro 3d bone matrix model that mimics the bone architecture will be used. this 3d model will require culturing differentiated mscs, allowing first the formation of a mineralized matrix, which should be degraded in a second step by ewing cells-activated pre-osteoclasts. both in vitro models will allow us investigating communications between tumor and bone cells and to study which and how messengers are exchanged between the different cell types. secreted factors activating osteoclast differentiation pathways (such as rankl or il6) will be particularly investigated. we will also have a special attention on tumor microvesicles recently described as new modulators of the tumor microenvironment which are able to transfer molecules into distant cells. in particular, it will be interesting to demonstrate a potential transfer of ews-fli1 protein from tumor cells to bone progenitors and to investigate its role in this new cellular context. 3) to investigate the role of each identified key genes in ewing-associated bone resorption. in vitro and in vivo studies will be performed using either inhibition (by si- or sh-rna) or expression (gene transfer) of the identified genes. read-out will be tumor or cellular growth and development of osteolysis or matrix destruction, in in vivo mouse models and in in vitro models, respectively. one goal of this project is to identify druggable bone resorption-activated target genes as potential therapeutic targets in ewing sarcoma. it is to be noted that preclinical validation of drug efficacy on both bone resorption and tumor growth could maybe be started but is out of the scope of this project. 4) to establish a new transgenic mouse model of es this is still lacking to es scientific community. for this purpose we to collaborate with the institut curie’s preclinical investigation laboratory either to develop a new spatiotemporal inducible ews-fli1 mouse model or to implement a preexisting mouse model, carrying a loxed ews-fli1 transgene, by crossing with a specific cre-ert bearing mice. from our previous collaborative work, we know that blocking bone resorption is a relevant new therapeutic option for the treatment of ewing sarcoma. the proposed project, which lays on solid scientific bases, will use innovative tools to dissect bone resorption mechanisms in ewing sarcoma and to test new hypotheses. expected results are clear identification of new key genes, pathways involved in es associated bone resorption and a possible identification of new drugs impairing es growth. moreover, the transgenic mouse model and the development of a 3d in vitro co-culture model will both be of prime importance to the ewing sarcoma’s community.