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contexte scientifique : au cours de ces 10 dernières années, le partenaire 1 a fait émerger le concept des récepteurs à dépendance (mehlen et al., nature, 1998- thibert et al., science, 2003). ces récepteurs partagent la capacité d'induire la mort cellulaire en absence de leur ligand respectif. cette faculté leur confère une activité de suppresseur de tumeur (mazelin et al., nature, 2004- mehlen and puisieux, nature rev cancer, 2006- bernet et al., gastroenterology, 2007). ainsi, l'inactivation de la voie des récepteurs à dépendance donne un avantage de croissance aux tumeurs. nt-3, trkc est un couple récepteur à dépendance, ligand et nt-3 est surexprimé dans une large fraction de neuroblastomes (nb) agressifs de stade 4. de plus, le fait d'interférer avec nt-3 est associé à la mort de cellules malignes de nb in vitro (bouzas et al., manuscript en préparation). le neuroblastome, la tumeur solide la plus fréquente chez l'enfant, provient de la dérégulation de la prolifération et de la différenciation des cellules de la crête neurale (ncc) lors de la formation du système nerveux périphérique (pns). descriptif du projet : ainsi, les principaux objectifs de ce projet sont (i) de définir le rôle du couple nt-3, trkc à la fois dans les progéniteurs des ncc et dans les cellules souches cancéreuses et (ii) d'analyser le taux d'expression de nt-3 dans les nb et notamment dans les "cellules souches". ce projet devrait nous permettre d'apporter une preuve de concept montrant que cibler nt-3 dans les neuroblastomes l'exprimant est une stratégie thérapeutique prometteuse. notre consortium développera alors 4 axes : axe 1 : confirmer que la surexpression de nt-3 constitue un avantage sélectif de survie pour les tumeurs agressives de nb. pour ce faire, nous réaliserons (i) des courbes de survie d'après la quantification du taux d'expression de nt-3, trkc dans une grande série de nb et (ii) une titration de nt-3 par un anticorps bloquant afin d'observer si cela conduit in vitro à la mort des cellules de nb exprimant nt-3 et in vivo à la régression tumorale. en plus du modèle classique de xénogreffes sur souris nude utilisé par le partenaire 1, le partenaire 2 utilisera un modèle de poulet avec injection de cellules de nb humain chez l'embryon pour mimer la migration des ncc. axe 2 : comprendre le rôle de nt-3, trkc pendant la migration des ncc. différentes approches sont envisagées comme la culture de cellules primaires de crête neurale et la sélection de différents progéniteurs (technique déjà développée par le partenaire 2) mais aussi l'analyse de souris mutantes pour nt-3, trkc et l'utilisation du modèle aviaire, dont le partenaire 2 est un expert reconnu. axe 3 : les cellules initiatrices de tumeurs de nb seront isolées de tumeurs fraîches grâce au travail collaboratif des partenaires 1 et 3 (d'après la technique du dr. d. kaplan). l'expression de nt-3, trkc dans ces "cellules souches" sera comparée à celle mesurée dans les tumeurs fraîches correspondantes. comme précédemment, l’apoptose de ces "cellules souches" sera mesurée lors de la titration de nt-3. axe 4 : développer une série de peptides permettant d'interférer avec nt-3. le partenaire 4 possède l'expertise et a déjà produit des peptides interférant avec d'autres couples récepteur à dépendance, ligand. ces peptides seront testés in vitro sur les cultures de progéniteurs de ncc et in vivo dans les modèles animaux. résultats attendus : ce projet devrait permettre (i) de générer des connaissances fondamentales originales sur le mécanisme de migration des cellules de la crête neurale lors du développement humain, en lien avec la notion de récepteur à dépendance, (ii) de confirmer l'implication dans la tumorigenèse du couple nt-3, trkc dans certains types de neuroblastomes et de mettre ainsi potentiellement en évidence un nouveau facteur pronostique ou diagnostique et surtout (iii) de faire la preuve de concept que nt-3 est une cible prometteuse pour la mise en place d'une stratégie thérapeutique ciblée dans les neuroblastomes surexprimant ce ligand.

scientific context: over the last 10 years, partner 1 has pioneered the concept of dependence receptors (mehlen et al., nature, 1998- thibert et al., science, 2003). these receptors share the ability of triggering cell death in the absence of their respective ligand. this, in turn, confers these receptors a tumor suppressor activity (mazelin et al., nature, 2004- mehlen and puisieux, nature rev cancer, 2006- bernet et al., gastroenterology, 2007). inactivation of this dependence receptor pathway thus becomes a selective growth advantage for a tumor. nt-3, trkc is a pair of dependence receptor, ligand and nt-3 is up regulated in a sizeable fraction of aggressive stage 4 nb. neuroblastomas, the most frequent solid tumours in children, arise from the deregulation in the fine control of neural crest cells (ncc) proliferation and differentiation during peripherical nervous system (pns) formation. partner 1 has recently shown that interfering with nt-3, trkc binding is associated with neuroblastoma cell death in vitro (bouzas et al., manuscript in preparation). description of the project: the main goals of the project are then (i) to define the role of the pair nt-3, trkc both in ncc progenitor cells and in cancer stem cells, (ii) to analyze whether the up-regulation of nt-3 in aggressive neuroblastoma is also observed in cancer stem cells and to provide a solid proof of concept that targeting nt-3 expressing nb is a promising strong approach for targeted therapy. our consortium will develop 4 aims: aim 1. to further confirm that nt-3 up regulation is a survival selective advantage for aggressive neuroblastoma. this will be done by both (i) investigating and analyzing (correlation, survival) the level of nt-3, trkc in a large fraction of nb and (ii) assessing that titration of nt-3 (using a blocking antibody) is associated with nt-3 expressing nb cell death in vitro and in tumor regression in animal models. in addition to classic engrafted nb cells in nude mice used by partner 1, partner 2 will set up a chicken model with injection of human nb cells to mimic ncc migration. aim 2. on a more basic aspect, to understand the role of nt-3, trkc during the migration of the ncc. this will be done by different approaches including the culture of primary ncc and the selection the different progenitors, according to methods developed by partner 2 but also the analysis of nt-3, trkc mutant mice and the use of the chicken embryo model, on which partner 2 has a large expertise. aim 3. nb tumor initiating cells will be isolated from fresh nb thanks to a collaborative work between partner 1 and partner 3 using a technique developed by dr. d. kaplan’s group. expression of nt-3, trkc in these “stem cells” will be compared to the respective fresh tumors. along the same line apoptosis induced by nt-3 titration of these “stem cells” will be analyzed. aim 4. to develop series of peptides that could block the nt-3, trkc interaction. partner 4 has a large expertise and already successfully developed peptides that interfere with a ligand of dependence receptor. these peptides will be tested in vitro, in culture of neural crest progenitors but also in vivo using in the animal models developed in aim 1. expected results: this project should allow (i) to generate original knowledge concerning the mechanisms of ncc migration during human development, in relation with the notion of dependence receptors, (ii) to confirm the implication in tumorigenesis of the pair nt-3, trkc in neuroblastoma subtypes and thus to propose a new potential prognostic or diagnostic marker and at last (iii) to prove that nt-3 is a promising target in order to develop a targeted therapy strategy for neuroblastoma overexpressing nt-3.