etude moléculaire et clinique des isoformes du récepteur activateur nkp30

rationnel : l’activation des cellules dendritiques (cd) par les effecteurs de l’immunité innée conditionne la nature des réponses immunitaires adaptatives. le récepteur activateur nkp30, spécifique des nk est impliqué dans l’activation des cd par les nk in vitro et dans la cytotoxicité des cellules tumorales et dendritiques immatures. peu de ligands de nkp30 ont été identifiés à ce jour à la surface des cellules tumorales ou dendritiques. nkp30 n’ayant pas d’orthologue murin, il est impossible de progresser dans la connaissance physiopathologique de ce récepteur en l’absence d’études cliniques systématiques. en effet, la pertinence des lymphocytes nk dans l’immunosurveillance antitumorale semble concevable eu égard aux résultats de l’équipe de vélardi sur le rôle majeur des kir (récepteurs inhibiteurs de nk) dans le phénomène de greffons contre leucémies aigues myéloblastiques. données préliminaires acquises : les banques de données indiquent l’existence d’un épissage alternatif du gène ncr3, nkp30 révélant 6 isoformes particulières aux fonctions inconnues - deux formes extracellulaires (ig-like domaine constant ou variable), chacune couplée à une isoforme du domaine intracytoplasmique (court, intermédiaire ou long). nous avons désigné des sondes spécifiques pour amplifier ces 6 isoformes en rt-pcr à partir des mononucléés circulants de 45 et 42 patients porteurs de sarcomes gastro-intestinaux (gist) ou volontaires sains (hv) respectivement. comme il n’existait aucune différence significative dans la proportion des isoformes extracellulaires entre gist et hv, nous avons établi un regroupement hiérarchique des proportions d’expression différentielle des isoformes courtes (cour), intermédiaires (inter) et longues (long). un profil courfortinterfaibl (profil a) s’est dégagé chez les gist de mauvais pronostic rechutant rapidement sous imatinib mesylate. en revanche, le profil inverse courfaiblinterfort (profil b) s’est révélé fortement représenté chez >2, 3 des hv et moins de 8% des gist ayant ce profil rechutent sous im à 45 mois de traitement. de plus, alors que l’expression de surface de nkp30 n’est pas prédictive, le profil a est associé à un déficit fonctionnel des nk pour la production d’ifn suite à une stimulation du nkp30. l’analyse génotypique des snps a montré une association forte entre la mutation ncr3*3790 localisée en 3’ utr du gène ncr3 et le profil transcriptionnel b. objectifs spécifiques : le projet propose i) but 1 : de définir au plan moléculaire et fonctionnel les transcrits alternatifs de nkp30 par clonage moléculaire et transfection dans des lignées candidates ii) but 2 :d’investiguer la valeur pronostique de ces isoformes de nkp30 chez les gist sous imatinib mesylate ou autres tumeurs dépendant des nk (lmc et neuroblastomes), iii) but 3 : de regarder les associations génotype nkp30 et isoformes du récepteur au plan épidémiologique et moléculaire (par constructions de minigène ncr3 porteurs de mutations ciblées de type snp), iv) but 4 : de moduler l’épissage alternatif par des composés actifs en clinique ou des oligonucléotides antisens , v) but 5 : de rechercher les ligands de nkp30 en générant des récepteurs solubles exprimant ces diverses isoformes. retombées et résultats attendus : la compréhension des fonctions différentielles des isoformes de nkp30 permettrait d’envisager de nouveaux outils cognitifs ou thérapeutiques dans le domaine de l’oncologie. nous postulons que le profil courfaiblinterfort (profil b) et, ou la présence du snp ncr3*3790 sera associé à un meilleur pronostic prévisible chez les gist traités par inhibiteurs de tyrosine kinases et pourrait permettre de sélectionner des donneurs de cellules souches ou moelle osseuse avant allogreffe. par opposition, nous prédisons que le profil courfortinterfaibl (profil a) est associé à un mauvais pronostic mais pourrait bénéficier d’un agent pharmacologique de types inhibiteurs d'histone déacétylase. les outils générés à partir de ce projet permettraient d’isoler des ligands de nkp30 et de faire progresser la connaissance du domaine.

scientific background: dendritic cells (dc) are cornerstones linking innate and cognate immunity. the activation of dc by innate effectors appears to represent a critical step in the regulation of acquired immune responses. the nkp30 is a master natural cytotoxicity receptor specifically expressed by nk cells and involved in the nk-mediated dc activation. nkp30 also plays a role at the effector phase in killing tumor targets and, or immature dc. few nkp30 ligands have been identified so far on the surface of transformed cells. clinical evidence that nk cells (and their inhibitory receptors) could be of prognostic significance has only been brought up in acute myeloid leukemia after allogeneic stem cell transplantation. the functional relevance of nkp30 cannot be studied in mouse models in the absence of a mouse orthologue for nkp30. therefore, the understanding of the biology and clinical relevance of nkp30 can only be investigated in human pathophysiology and remains sketchy. preliminary data: the human ncr3 gene is expressed as six differentially spliced transcripts : two types of extracellular domains exist (a variable ig- like domain and a constant ig- like domain), each of them being linked to one of the three distinct intracellular domains (short, intermediate and long tail). to investigate the clinical and functional relevance of the six nkp30 isoforms, we analyzed the nkp30 transcriptional profile of 45 gastrointestinal sarcoma (gist) bearing patients (all treated with imatinib mesylate) and 42 healthy volunteers (hv). specific primers were designed for each nkp30 isoforms in order to quantify the 6 transcripts using rt-pcr method on all pbmc. using a hierarchical clustering approach based on these short, inter and long isoforms, we were able to segregate the patients’ cohort in 2 groups. patients presenting with the shorthigh-interlow profile (called « profile a ») exhibited an accelerated time to progression. in contrast, most of the patients exhibiting a shortlow-interhigh profile (called «profile b») did not relapse at 46 months of imatinib mesylate. moreover, the majority of hv (62%) exhibited the favourable profile b. the functional characterization of these two profiles revealed a significant association between the shorthigh-interlow profile a and a low production of ifn by nk cell upon nkp30 cross-linking in vitro (on purified nk cells). the nkp30 shortlow, interhigh profile b is associated with the ncr3*3790 mutation localised in the 3’ untranslated region of ncr3 gene. specific aims: aim 1 is a molecular and functional characterization of the nkp30 isoforms using differential cloning and transfer into nkp30 deficient cell lines. aim 2 is to determine the prognostic value of the nkp30 isoforms in gist cancer patients treated by imatinib mesylate (and also in chronic myeloid leukemia and neuroblastoma) in terms of progression free survival. aim 3 will investigate associations between genotype (single nucleotide polymorphisms in the promotor and ncr3 gene) and splicing variants of nkp30 in patients and healthy volunteers and will establish a molecular link between snps and alternative splicing (using a minigene construct containing the targeted mutations). aim 4 is to modulate alternative splicing of nkp30 in vitro using drugable compounds (such as hdac inhibitors) or specific antisens oligonucleotides. aim 5 will search for putative ligands for the distinct nkp30 isoforms in dc and tumor cells (using nkp30-fc bearing constant or variable regions of the extracellular domain). expected results: we aim at validating the favourable prognostic significance of bearing a phenotype nkp30 shortlow, interhigh profile b (and, or ncr3*3790 mutation) for the response to tyrosine kinase inhibitors in gist (and potentially in other nk cell-dependent human malignancies). in contrast, for those individuals presenting with a nkp30 shorthigh, interlow profile b, we expect to demonstrate that pre-treatment of autologous nk cells with hdac inhibitors or specific antisens oligonucleotides will reverse the phenotype towards a profile a with functional consequences on ifn production. we believe that the novel reagents generated by subcloning of these isoforms could contribute to find out nkp30 ligands. we would like to think that the demonstration of a prognostic significance of the nkp30 isoforms will contribute to select ideal donors of bone marrow or stem cells in allogeneic transplantation models.