analyse d'un gène suppresseur de tumeur candidat des leucémies aiguës lymphoblastiques : syncrip , hnrnp-q

les leucémies aiguës lymphoblastiques (lal) représentent le plus fréquent des cancers de l’enfant. environ 15% des lal sont de phénotype t (lal-t). l’analyse des remaniements chromosomiques et des profils d’expression a permis de définir les sous-types oncogéniques des lal-t associés à la dérégulation de facteurs de transcription oncogéniques. un évènement additionnel fréquemment retrouvé dans les lal-t, et plus généralement dans la pathologie lymphoïde, est la délétion partielle du bras long du chromosome 6. ces del(6q) récurrentes suggèrent la présence de gène(s) suppresseur(s) de tumeur dans cette région génomique. mon projet de master consistait à analyser précisément les del(6q) dans une série de lal-t. j’ai ainsi (1) analysé par cgh-array une série de lal-t et défini une région minimale délétée de 3.2 mb en 6q14-q15, (2) dessiné et hybridé une puce 8x15k dédiée au 6q avec une résolution <0.5 kb, ce qui a permis d’identifier une région délétée de 30 kb dans 2 cas, contenant un seul gène appelé syncrip, (3) amplifié et séquencé les points de cassure de la délétion dans ces cas, (4) séquencé syncrip dans 34 cas de lal-t avec ou sans del(6q), sans mettre en évidence de mutations. l’ensemble de ces résultats suggère un mécanisme d’haploinsuffisance impliquant syncrip. de façon intéressante ce gène code hnrnp-q, une ribonucléoprotéine nucléaire impliquée dans la maturation des pré-mrnas (épissage et édition). mon projet de thèse est d’analyser le rôle de syncrip, hnrnp-q dans l’oncogenèse des lal-t et de modéliser son mode d’action tumeur suppresseur potentiel. mes objectifs sont : (1) achever la caractérisation moléculaire des lal-t avec del(6q) : par l’analyse des niveaux d’expression des transcrits et isoformes protéiques de syncrip dans les cas délétés et non délétés - par profilage génome, transcriptome des lal-t (les données d’expression sont disponibles des projets antérieurs), afin d’identifier une signature del(6q) qui devrait inclure les voies biologiques d’aval. (2) analyser finement la maturation post-transcriptionnelle (épissage et édition) dans des lignées de lal-t modifiées exprimant ou pas hnrnp-q. pour cela j’inhiberai syncrip par shrna dans des lignées sans del(6q), et à l’inverse le réexprimerai dans des lignées avec del(6q), puis comparerai les caractéristiques de la maturation des mrnas dans ces lignées par un ensemble de tests fonctionnels développés sur le site dans l'équipe de d. auboeuf (dynamique de l’épissage, analyse des profils d’épissage pan-exons, tests in vitro d’édition). (3) tester un rôle potentiel de syncrip dans la différenciation thymique: expression dans des fractions thymiques normales, analyse des conséquences de l’inhibition de syncrip sur la différenciation et la prolifération des thymocytes dans le système de différenciation thymique in vitro op9-dl1 (utilisé dans notre équipe en collaboration avec jc bories). (4) selon la progression de ces expériences, une approche in vivo sera initiée par inactivation de syncrip dans des souris transgéniques tal-lmo disponibles dans le laboratoire (qui développent des lal-t en quelques mois). (5) enfin, en parallèle, j’analyserai des séries de patients inclus dans les protocoles nationaux (graall et fralle) en utilisant la puce dédiée au 6q que j’ai déjà dessinée et validée. ce projet devrait nous permettre de comprendre le rôle oncogénique des del(6q), souvent associées à la progression tumorale. la fonction normale du gène syncrip, contenu dans la région minimale délétée que j'ai identifiée, suggère un rôle original dans l’oncogenèse via des changements de maturation des mrnas et je chercherai à le confirmer par des tests fonctionnels spécifiques. la modulation de syncrip devrait permettre de préciser son implication dans les lal-t et dans le développement thymique normal. enfin, le criblage de patients inclus dans les protocoles permettra de déterminer la valeur pronostique des del(6q) et éventuellement d’adapter la prise en charge.

acute lymphoblastic leukemia (all) is the most common cancer in children- around 15% of the all are of t-lineage phenotype (t-all). oncogenic subtypes associated to the deregulation of a transcription factor have been defined by the molecular analysis of chromosomal abnormalities and by gene expression profiling. an additional and frequent event in the t-all, and more generally in lymhoid neoplasia, is the partial deletion of the long arm of chromosome 6 (6q). these del(6q) are often associated with leukemic progression and remain to date non elucidated. during my master (1) i analyzed a series of t-all using cgh-array and defined a minimal deleted 3.2 mb region at chromosome 6q14-q15- (2) i designed and hybridized a custom 8x15k array dedicated to 6q with an ultra-high resolution (<0.5kb) that allowed me to identify a cryptic 30 kb deleted region in two t-all cases, containing a single gene called syncrip- (3) i amplified and sequenced the breakpoints of the deletion in these two cases - (4) i sequenced syncrip in 34 cases of t-all, with and without del(6q), but found no mutation. altogether, these results suggest haploinsufficiency as the mechanism of tumor suppressor oncogenesis in del(6q) cases. interestingly, syncrip encodes hnrnp-q, a nuclear ribonucleoprotein which is likely to be involved in mrna maturation processes like splicing and editing. my phd project is to analyze into details syncrip , hnrnp-q in t-all oncogenesis and follow its action as a potential tumor suppressor gene. my plans are : (1) to achieve the molecular characterization of t-all with del(6q) by the analysis of levels of syncrip transcripts and protein isoforms expression, comparing deleted and undeleted cases - to profile at the genomic, transcriptomic level t-alls with or without del(6q) (large scale expression data are available from previous studies) in order to identify the biological pathways targeted by the del(6q). (2) to analyze the mrna maturation in modified cell-lines for hnrnp-q expression. to that purpose, i will inhibit syncrip by shrna in cell lines without del(6q), and, on the other hand, re-express it in cell lines with del(6q), then i will analyze and compare the characteristics of mrnas maturation in these cells using a range of functional tests developed in d. auboeuf team in our institute (dynamic of splicing, genome-wide splice by pan-exons profiling analysis, and editing modifications). (3) to test a potential role of syncrip in thymic differenciation. expression will be analyzed in sorted human thymic subpopulations (already available in our lab), and the consequences of syncrip silencing in dn cells will be tested in the op9-dl1 in vitro system of thymic differentiation (already used in our institute in collaboration with jc bories). (4) according to the progression of these experiments, an in vivo inactivating approach could be initiated in transgenic tal1-lmo1 mice (available in our laboratory). (5) at the clinical level, i will analyze large series of patients included in national protocols (graall and fralle) using the dedicated 6q array which i previously validated. this project should allow us to get insights in the oncogenic role of deletion 6q. because of the likely normal function of syncrip in mrna modification, i will functionally test the hypothesis of oncogenesis through deregulation of these functions. modulation of syncrip, contained in the minimal deleted region that i identified, should allow to precise its implication in t-all and in normal thymic development. lastly, the screening of cases of leukemia included in protocols will help us to determine a prognostic value associated with del(6q) and may lead to adapt therapeutic (for example intensification by hematopoietic stem cell transplantation).