rediriger les lymphocytes t cytotoxique contre les antigènes leucémiques. redirecting cytotoxic t lymphocytes to leukemia antigens.

contexte scientifique. la réinjection de lymphocytes du donneur (dli) après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (hsct) vise à obtenir un effet du greffon contre les blastes leucémiques (effet gvl). les efforts déployés pour optimiser cet effet tout en évitant la maladie du greffon contre l’hôte (gvhd) restent décevants. l’expansion ex vivo de lymphocytes t anti leucémiques spécifiques s’est avérée difficile car les donneurs sont naïfs vis-à-vis des blastes leucémiques. les blastes leucémiques sont par ailleurs peu immunogènes car exprimant faiblement les molécules de costimulation (cd80, cd86). descriptif du projet. nous avons généré des lymphocytes t cytotoxiques (ctl) génétiquement modifies capables d’éradiquer les blastes de leucémie aigue myéloblastique (lam). par transfert de gène rétroviral, nous avons dote ces ctl de récepteurs t chimériques (tcr) comportant un fragment hypervariable d’anticorps dirige contre l’antigène cd33 des lam couple a la chaine du complexe cd3. l’originalité de notre approche repose sur l’utilisation de ctl anti-ebv capables de perdurer de façon prolongée in vivo chez les patients ebv+. ceci reflète non seulement la persistance des antigènes ebv in vivo mais aussi les robustes propriétés de costimulation des cellules ebv+ présentes de façon chronique chez ces sujets. nous proposons d’exploiter ce phénomène en redirigeant ces ctl anti-ebv contre des blastes de lam, eux mêmes déficients en molécules de costimulation. nos travaux préliminaires démontrent que des ctl anti-ebv transduits par des gènes codants pour des tcr chimériques persistent in vivo grâce à la stimulation via leur tcr natif par des lymphocytes b immortalises par l’ebv. notre hypothèse est que des ctl bispécifiques sont capables de lyser in vitro et in vivo des blastes cd33+ via leur tcr chimérique. nous avons d’ores et déjà confirme l’activité anti-leucémique spécifique de nos ctl chimériques sur des blastes cd33+ in vitro et in vivo dans un modèle murin de xénogreffe de leucémie humaine. nous souhaitons désormais poursuivre nos travaux pour: objectif 1. améliorer l’efficacité anti-leucémique de nos ctl bi-spécifiques en modifiant leur tcr chimérique par introduction de séquences codant pour des molécules de costimulation (cd28, 4- 1bb et ox40) activatrices du système immunitaire (tcr chimériques dit de 2eme génération). objectif 2. vérifier dans un modèle murin de reconstitution hématopoïétique normale et leucémique l’innocuité de ces ctl chimériques anti-cd33 sur les cellules hématopoïétiques normales et leur effet thérapeutique sur les cellules leucémiques ainsi que sur la cellule souche leucémique cd33+. résultats attendus. a l’issue de ce projet, nous escomptons avoir démontré que : 1) l’introduction de molécules de costimulation dans le domaine de signalisation du récepteur cd33-z permet d’augmenter la transduction du signal, et améliore l’effet anti-leucémique des ctl chimériques in vivo- 2) l’activité anti-leucémique des ctl chimériques est corrélée a l’augmentation de la survie des souris nod-scid transplantées, avec une toxicité acceptable sinon réversible sur les précurseurs myéloïdes normaux. ce projet s’inscrit dans un programme de recherche soutenu par la communauté européenne (strep fp6) coordonne par raphael rousseau, responsable du projet. ce consortium met en place un essai thérapeutique de phase 1 dans les leucémies aigues lymphoblastiques cd19+. le projet propose ici a donc pour but principal de poser les bases rationnelles permettant l’obtention de l’autorisation d’un essai clinique multicentrique de phase 1-2 utilisant des ctl chimériques cd33-z chez des patients adultes et pédiatriques atteints d’une leucémie aigue myéloblastique cd33+ réfractaire ou en rechute.

scientific context. following hematopoietic stem cell transplantation (hsct), infusion of donor t cells (dli) may mediate a graft-versus-leukemia (gvl) effect. efforts to exploit this activity but avoid the graft versus host disease (gvhd) have had limited success. ex vivo expansion of leukemia specific t cells from stem cell donors has proved difficult because these donors may be tumor-antigen naive. furthermore, most leukemic blasts are poorly immunogenic because they express low levels of costimulatory molecules such as cd80 and cd86, so that generation of antileukemic effector t cells may be problematic even when these cells are obtained from the tumor-bearing host. description of the project. in an effort to redirect the immune system to eradicate leukemia recurrence, we have confirmed the potency of chimeric tcr to target acute myeloid leukemia (aml) blasts. these chimeric tcr contain single-chain fragments (scfv) from the amlspecific cd33 surface marker and the cd3 complex z chain. we now propose to enhance their cytotoxic activity by adding costimulatory elements into the t receptor (cd28, 4-1bb and ox40). the originality of our proposed work is to take advantage of ebv-specific ctls for their considerable ability to proliferate and survive in vivo and to kill ebv antigen-expressing tumor targets. this activity likely reflects the persistent expression of ebv antigens in vivo and the robust co stimulation provided by the infected target cells, which are excellent antigen presenters. we propose to exploit this phenomenon by retargeting ebv-ctls to myeloid leukemia cells, which themselves lack many of the costimulatory molecules needed to activate ctls. based on our previous preclinical and clinical experience, transduced ebv-cytotoxic t cells (ctls) will persist in response to stimuli from ebv-positive cells when stimulated through their native tcr. we hypothesize that these bi-specific cells will also kill in vitro and in vivo cd33+ leukemia cells recognized by their leukemia-targeted chimeric tcr. in order to test our hypothesis we will: - attempt to increase the activity of the chimeric ebv-ctls by modifying the molecular structure of the chimeric receptor to favor enhanced recruitment and persistence of cytotoxic effector function following engagement of the leukemic target (aim 1). - evaluate the antileukemic activity of chimeric t cells against a human cd33+ aml in vivo in nod-scid mice (aim 2). moreover, we will test the safety and the potency of these different chimeric ctls in a human cd33-positive aml xenograft model in nod-scid mice. expected results. we anticipate that introducing costimulatory response elements into the signaling domain of the cd33-z receptor will enhance signal transduction and improve the effect of the anti-leukemia effectors (aim 1). we expect that the modified chimeric receptors will have a potent antileukemia effect on myeloid blasts that correlates with increased survival in nod-scid mice with acceptable, if not reversible, toxicity on normal myeloid progenitors (aim 2). if effective, we will seek approval to initiate a phase 1-2 clinical trial of chimeric ctls in ebv-seropositive patients with relapsed or high-risk cd33+ leukemia within our eu-funded consortium for the treatment of adult and pediatric malignancies using chimeric t cells (strep fp6, coordinator: raphael rousseau).