effet de l’acide retinoïque sur la réponse immunitaire humorale dans les leucémies aigues myéloïdes et les syndromes myélodysplasiques. etude dans des modèles murins et chez des patients.

contexte scientifique les rétinoïdes utilisés pour leurs propriétés différenciantes, sont aussi immunomodulateurs. la cellule leucémique peut induire des réponses immunes innée et adaptive, via l’expression d’antigènes associés aux leucémies (laa). l’immunogénicité de laa [transcrits de fusion, oncogènes (erbb2, bcl2, protéinase 3..) ou non spécifiques (wt1, prame..)] a déjà été montrée et des essais de vaccination peptidique ont montré la possibilité d’induire une réponse immune anti-tumorale. dans un modèle murin de leucémie aigue promyélocytaire (lap), la vaccination adn (adn codant pour une séquence de 105 paires de bases de l’oncogène de fusion, pml-raralpha, fusionnée avec le fragment c de la toxine tétanique) avec ou sans acide rétinoïque, a permis une prolongation de la survie associée à des réponses immunes spécifiques, en particulier à la production d’anticorps anti-rar (padua et al, 2003, robin et al, 2006). ces anticorps étaient associés au traitement par l’acide rétinoïque et à la survie des animaux. ces anticorps ont aussi été identifiés chez des patients atteints de lap, et leur titre augmente après traitement d’entretien (incluant de l’acide rétinoïque). descriptif du projet l’objectif du travail est la caractérisation des réponses immunitaires humorales induites par le traitement par l’acide rétinoïque dans les modèles murins de lap (modèle transplantable obtenu par injection de cellules de rate de souris transgéniques pml-rar), de leucémies aigues myéloïdes (lam) et de syndromes myélodysplasiques (smd) (modèles de souris transgéniques pour les mutation ras et bcl2), et chez des patients atteints de ces pathologies. le projet repose sur la mise en évidence et la caractérisation des anticorps associés aux leucémies dans les lam (en particulier la lap) et les smd, dans des modèles murins et chez les patients. un certain nombre d’anticorps ont déjà été mis en évidence par elisa (anti-rar) ou par immunofluorescence indirecte (ana et anca). le projet associera : - la quantification des anticorps et l’étude de leur spécificité vis-à-vis de différents antigènes : anti-rar, anti-pml, anti-pml-rar, anca, ana, anti-elastase, anti-protéinase 3, anti-wt1 - la cinétique des anticorps au cours du traitement - la caractérisation des isotypes - le phénotypage des sous-populations lymphocytaires cd4, cd8 - la sécrétion des cytokines caractéristiques de réponses immunes de type th1 (il2, ifn , tnf ) et th2 (il4, il10) - l’étude fonctionnelle in vitro des anticorps : capacité de fixation des anticorps sur des cellules leucémiques (par fluorescence facs), mise en évidence d’une fonction cytotoxique des anticorps dépendant du complément (par des tests de microtoxicité), sur la lignée leucémique nb4 - l’étude fonctionnelle in vivo des anticorps : par immunothérapie passive chez les souris. les modèles murins ont été établis, une sérothèque a été constituée chez des patients atteints de lap et est en cours de constitution pour les patients atteints de smd. le laboratoire a par ailleurs entrepris de cartographier la réponse immunitaire humorale par une technique de protéomique, incluant une première étape de séparation des anticorps, puis élution des peptides immunogènes et enfin analyse et identification des ces peptides par spectrométrie de masse (sm), avec une quantification par marquage avec des isotopes stables (technologie itraq). les laa induits par le traitement par l’acide rétinoïque seront recherchés dans des serums de souris puis de patients avant et après traitement. résultats attendus dans les essais cliniques d’immunothérapie et en particulier de vaccination anti-tumorale, il est nécessaire d’établir des outils de monitoring des réponses immunes pour évaluer leur effet anti-leucémique. la recherche et la quantification de différents anticorps (anti-rar, anti-pml, anti-pml-rar, anti-elastase, anti-protéinase 3, anti-wt1) par des techniques de type elisa permettent de déterminer si le profil immun des patients peut avoir un impact pronostic sur l’évolution de la maladie et la réponse thérapeutique. les études fonctionnelles (profils de sécrétion de cytokines, cytotoxicité dépendant des anticorps, cinétique des anticorps) sont entreprises afin de déterminer le rôle du système immunitaire dans l’obtention d’une rémission ou la protection des rechutes enfin l’identification de laa induits par l’acide rétinoique par une technique de protéomique permettra de caractériser de nouvelles cibles thérapeutiques dans les stratégies de stimulation de réponse immunitaire anti-tumorale par des thérapies immunitaires spécifiques (de type vaccinales) ou adjuvantes (comme l’acide rétinoïque).

scientific context retinoids which are used as a differenciation therapy in oncology, are also immunomodulators. leukemic cells may induce innate and adoptative immune responses, by expressing leukemic associated antigen (laa). immunogenicity of identified laa [like fusion proteins, oncogenes (bcl-2, erb-b2, protéinase 3...) or unspecific antigens (wt-1, prame…)] is currently investigated and peptide vaccination has shown to be effective to induce adoptative anti-tumoral immune responses. in a murine model of acute promyelocytic leukaemia (apl), dna vaccination (using dna encoding for a 105 base paired sequence of the fusion oncogene, pml-raralpha fused to tetanus toxin fragment c), with or without atra, extends survival of treated mice (padua et al 2003) and is associated with the appearance of antibodies recognizing raralpha (padua et al 2003, robin et al 2006). these antibodies were especially detected in atra treated mice and associated with increased survival. in the sera of patients with apl, anti-rar antibodies have been identified, with an increased titre after consolidation therapy (including atra). description of the project the aim of this project is to better characterize humoral immune responses induced by atra therapy in murine models of apl (an apl transplantable model created by transplanting cells from the spleen of an apl transgenic mice –bearing the human pml-raralpha oncogene- into syngeneic recipients), of myelodysplastic syndromes (mds) and acute myeloid leukemias (aml) (transgenic mice with mutated ras and bcl2 oncogenes), and in patients with apl, aml and mds. the characterization of humoral immune responses will associate : • quantitation of antibodies and identification of their specificities : anti-raralpha, anti-pml, anti-pml-raralpha, anca, ana, anti-elastase, anti-proteinase 3, anti-wt-1 • kinetics of antibody production in the setting of therapy • study of isotypes • phenotyping of t cell populations • study of cytokine secretion profiles for th1 and th2 responses (il2, ifn , tnf and il4, il10 respectively) • in vitro functional study of antibodies activity : binding on leukemics cells (by fluorescence facs), complement dependant cytotoxicity measured by microcytotoxicity assay on leukemic cells lines • in vivo functional antibody activity by passive immunotherapy study in mouse models. murine models of apl and mds have already been established and validated in the laboratory- sera are available for apl patients and will be collected for mds patients. the laboratory has also undertaken the identification of laa by proteomic studies, including the separation of antibodies, followed by the elution of immunogen peptides (laa). the identification and quantitation of peptides will then performed by mass spectrometry associated to the itraq methodology (isobaric tags for relative and absolute quantitation). laa induced by retinoic acid will be identified in the sera from mice and then patients before and after treatment. expected results in murine models of aml, apl and mds, and furthermore in patients, experimental data about the immune response profiles and the correlation with the therapeutic response or the relapse, may help to better individualise targeted therapy for each patient. in clinical vaccine protocols, biological markers have to be established for the monitoring of anti-leukemic immune response. the quantitation of different antibodies (anti-raralpha, anti-pml, anti-pml-raralpha, anti-elastase, anti-proteinase 3, anti-wt-1) may allow to determine if the immune profile of patients has a prognostic impact and is correlated to the therapeutic efficacy and survival of patients. the functional characterization of antibodies which will be undertaken by in vitro as well as in vivo tests will enable us to elucidate the role of immune system in the remission or the relapse of patients. the identification by proteomic studies of laa induced by retinoic acid will allow the characterization of new therapeutic targets in the setting of specific (like dna or peptide vaccines) or non specific adjuvant immune therapies (like the adjuvanticity of retinoic acid).